发布时间 : 星期三 文章浙江大学医学院神经生物学实验室常用实验流程更新完毕开始阅读
浙江大学医学院神经生物学实验室常用实验流程
1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收 2、感受态细胞的制备 3、DNA的转化
4、小量质粒DNA提取和纯化 5、中量质粒DNA提取和纯化 6、聚合酶链式反应操作（PCR） 7、点突变形成 8、诱导表达及检测
9、SDS-PAGE和WESTERN BLOT 10、免疫共沉淀（HEK293T细胞） 11、免疫组化
12、细胞培养注意事项及常用溶液配置方法 13、细胞传代培养（消化法） 14、细胞的复苏 15、细胞冻存
16、海马神经元原代培养 17、免疫细胞化学
18、HEK 293T细胞转染 (10cm培养皿) 19、磷酸钙介导的神经元转染 20 Co--IP
21 MBP-PICKI表达纯化 22 RNA提取步骤 补充 磷酸钙转染 溶液配置
目 录
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1、琼脂糖电泳分离的DNA片段的回收
（详见Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒产品说明。） 准备工作：调整到75°C水浴；在Buffer W2 中按标签上指定的体积加入无水乙醇。 记录每个1.5 ml Eppendorf（自备）的重量：为A重量（g）
分别将两小块胶（cDNA和载体）切下、切碎，放入1.5 ml Eppendorf，再次称重： 为B重量（g）
加入3×(B-A)ml的DE-A液，75°C×7min （使胶溶解完全） 加入1.5×(B-A)ml的DE-B液，混匀 (翻转混匀即可)
短速离心，使管壁和管盖上的溶液沈降到管底。
将DNA制备管放入2ml离心管（试剂盒提供）中。将以上混合液，加入DNA制备管，5000rpm离心1分钟
弃去滤液，将制备管放回到2ml离心管中，加入0.5ml W1溶液，5000rpm离心1分钟
弃去滤液，将制备管放回到2ml离心管中，加入0.7ml W2溶液，5000rpm离心1分钟 重复一次
将DNA制备管放回到2ml离心管中，12000rpm×1min，弃此2ml离心管
将DNA制备管放入无菌1.5ml 离心管（试剂盒提供）中，在DNA制备膜正中加25ul Eluent 静置1min
12000rpm×1min，收集DNA, 约25ul
2、感受态细胞的制备
实验准备：无抗性LB平板，1ml装、6ml装LB小管，100ml装LB锥形瓶，0.1mol/L的氯化钙，0.1mol/L
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的氯化钙加15%的甘油，50ml离心管。
实验步骤：因为整个过程中没有使用抗生素所以要特别注意无菌操作！ 1.铺无抗性的LB平板。为避免意外，一般铺两块无抗性LB平板。
2.用1ml的枪戳几下菌库中的菌种,使得枪头上带有少量冰渣。这个过程要迅速，避免菌种发生冻融或污染。
3.将冰渣溶于1ml 37℃预热的LB中,充分混匀后,用枪吸取20ul转移至另一只装有1ml 37℃预热的LB的 EP中,混匀后取100ul涂板。37℃孵育14个小时。观察菌落数量和相关理化特征，用封口膜密封4℃冻存。
4.用牙签挑取单克隆至4～6ml无抗性LB小管中260rpm 12小时(活化)。这一步可以多挑几个克隆，以防其长不出来和有明显的污染。
5.取500ul菌液到100ml无抗生素的LB锥形瓶中300rpm 3小时。注意观察，控制菌的浓度在OD600时不要超过0.6。
6.把100ml菌液分装在两只50ml离心管（已灭过菌）中，冰浴10分钟。 7.5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。离心机需要4℃预冷。
8.用0.1mol/l的氯化钙10ml重悬浮。徒手将50ml离心管反复戳于冰上从而使细菌重悬浮。因为感受态细胞比较脆弱易破损，故重悬浮时不宜使用震荡仪。悬浮要充分！ 9. 5000rpm、4℃离心10分钟，弃上清。
10.用0.1mol/L的氯化钙加15%的甘油2ml重悬浮。注意事项同8。 11.以200ul每管分装，分装后冻存于-80℃。注明制备日期和菌名。
注意事项：因为培养基无抗性，故无菌操作是整个感受态制备的关键。制备过程最好带上口罩，所有的用具需要充分灭菌。为了保证感受态的质量所有的步骤都需在冰上进行。 方法二：
做感受态细胞步骤：（材料要灭菌，并无菌冰上操作）
1， 从-70度拿出库存的大肠杆菌，用划线涂布法接种于不加任何抗生素的基本培养皿上（取稀释之意 ，或拿1ml
枪头在冰上没融化的菌中浸一下，放入1ml LB 中，再吸20ul入另一个1ml LB中，再吸另一个的100ul铺板）37度倒置培养12－16小时（DH-5a）
2， 挑一克隆于6ml不加任何抗生素的LB中，250r/min 37度， 振12小时。培养皿挑好后放入4度冰箱
3， 吸500ul 菌液于不加任何抗生素的LB 100ml 锥形瓶中，300r/min 37度， 振3小时，然后把锥形瓶放在写有字
的纸上，透过菌液可看清纸上的字，并测OD约为0.6（吸1ml）,如果每到这个值就再大约摇半小时再测OD约为0.6就可以。
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4， 将两个50ml试管冰上预冷，再将培养液放入（倒入）其中，冰上10分钟。 5， 7号转头4度 5000 rpm 10分钟
6， 弃干上清，扣干凉1分钟，再各加10ml 0.1mol/L CaCl2 (每50ml 菌液10ml CaCl2) (CaCl2不含甘油，从4度
拿出在冰上预冷，用无菌移液管吸)
7， 冰上轻旋摩擦开菌斑（要轻，并且所有内容物保持在冰中）之后再放在冰上30分钟。 8， 4度 4100 rpm 10分钟 9， 弃上清，扣干凉1分钟
10， 两管各加含甘油CaCl2 2ml (每50ml菌液加2ml甘油CaCl2) (其中15体积甘油Glycerol 85体积CaCl2, 从4
度拿出在冰上预冷, 用枪吸), 再用同样的方法冰上轻旋摩擦开菌斑 11， 在冰上分装100ul或200ml 的多个管子 12， -80度冷藏
3、DNA的转化
准备工作：制冰，42°C水浴，37°C摇床，37°C预热LB
自制的感受态细胞
加20ul 连接产物
冰上30 '
O
42 C水浴90秒（热休克，时间要求精确）
冰上2'
加800ul LB(-) (预先37 OC预热)
摇床，37 OC 225转/分 45分钟
O
400ul菌液涂平板，37C温箱中培养过夜
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的
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