发布时间 : 星期六 文章感受态细胞的制备及转化更新完毕开始阅读
37℃ 孵育1h；
6、取100μl菌液，接种于含抗生素的LB平皿（也可以把菌液2000 rpm离心5 min，收集细菌，用预热LB重悬细菌，接种含抗生素的LB平皿上），37℃ 孵育过夜。
7、剩余的感受态，可做阴性对照。 三）注意事项
1、本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。
2、PEG 和MgCl2二者均可沉淀质粒DNA，且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能；这些可能是优于CaCl2 法的原因。
3、培养基PH值。pH值在6.8-7.2之间较好。保证菌摇好后，pH值不低于6.0。pH值在6.5以上，表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。
4、培养基离子浓度。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。使用20mmol/L MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
5、培养温度。文献及经验证明，较低的温度培养有利于感受态的形成（一般18℃,一般的感受态，用室温即可），有利于获得较高转化效率的感受态。
6、感受态保存。文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要
好,它会使感受态的效率增加。浓度不要超过7%。液氮速冻也会使感受态的效率提高，可用液氮速冻感受态12小时，然后保存于超低温冰箱内；也可在液氮中长时间保存而不降低效率。
7、热休克时间。有实验证明热休克时间30s能取得最好效果，而温度40-50℃均可，转化效率下降不明显。
8、转化质粒建议不要超过10ng，否则容易导致效率下降。 9、试剂使用国产分析纯即可，一定要过滤除菌，不能高压灭菌。
四、 结果判定
转化后的菌液，分3个梯度DNA量，转化三个LB平皿，计算平均转化效率。
转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆、有限量的DNA的转化、T-克隆实验；大于1×10 8 cfu/μg DNA可用于构建文库和突变要求用的转化。
转化效率计算公式：
转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量（cfu/μg DNA）
这是最常用的方法，即计算每微克DNA经转化后可以得到的阳性克隆菌落的数目(clone formation unit, cfu)。但实际上，由于用于测定转染效率的质粒（一般要求超螺旋质粒）的分子量不同，每微克DNA所代表的DNA分子数也会有差异，因此一般情况上，转化效率测定使用的都是pBR322或pUC19等小分子量的质粒。
使用一个具体的例子来说明转化效率的计算方法：假设取0.1ng
pUC19质粒转入100μl待测的感受态细菌中，按常规转化步骤进行冰浴和热击，加入900μl SOC培养基继续培养（此时DNA浓度为0.1ng DNA/ml，这里也可使用LB培养基，但最后得到的克隆菌的数目可能会降低）。然后再用SOC培养基进行1:10稀释（此时DNA浓度变为0.01ng DNA/ml），分别取100μl（含总量为0.001ng的DNA）涂布至两个平行的平板中。如果最后产生的菌落数为200 个（两个平板菌落的平均数），则转化效率为：
200 cfu/0.001ng = 2×108 cfu/μg（注:2×108 cfu/μg的转化效率，大约相当于可以将千分之一的pUC19质粒分子成功转入感受态细菌中。）