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第三节 中药有效成分化学结构的研究方法
【化合物纯度的判定方法】 1．结晶均匀、一致。
2．熔点明确、敏锐（0.5~1.0℃）。
3．TLC (PPC):三种以上不同展开剂展开，均呈现单一斑点。 4．HPLC、GC也可以用于化合物纯度的判断。 【中药有效成分的理化鉴定】 1.物理常数的测定
包括熔点、沸点、比旋度、折光率、比重等的测定。 2.分子式的确定
一般先进行元素分析，得到元素的种类及各元素的百分含量，再测定分子量，求得分子式。目前最常用的是质谱法。
3.化合物结构骨架与官能团的确定
一般首先确定化合物的不饱和度，准确计算出结构中可能含有的双键数或环数。用各类化合物的显色反应判断化合物骨架或官能团。或用IR光谱来判断结构中的官能团信息。 【四大光谱在结构测定中的应用】
1．紫外-可见光谱（UV -VIS）—— 共轭体系特征
（1）原理
分子中电子跃迁（从基态至激发态）。其中，n-π*、π-π* 跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现在光的紫外区（200~400nm）和可见区（400~700nm）。 （2）应用：
?推断化合物的骨架类型—— 共轭系统。
?取代基团的推断。如加入诊断试剂推断黄酮的取代模式（类型、数目、、排列方式）。 ?用于含量测定（以最大吸收波长作为检测波长进行含量测定）。 2．红外光谱（IR）
分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而测得的吸收图谱，称为红外光谱。
-1
（1）特征频率区（4000～1500 cm）
-1
用于特征官能团的鉴别：①羟基（酚羟基、醇羟基） 3600～3200 cm
-1
游离羟基 约3600 cm
-1
氢键缔合羟基 3400～3200 cm
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②羰基 1800～1600 cm
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酮 约1710 cm
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酯 1735～1710 cm
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③芳环 1600、1580、1500 cm有2～3个峰
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双键 1680～1620 cm
-1
（2）指纹区（4000～1500 cm） 用于化合物真伪的鉴别。
两个化合物完全相同的条件：①特征区完全吻合；②指纹区也完全一致。 3．核磁共振谱
1
（1）H-NMR（核磁共振氢谱）
信息参数：化学位移（δ）、峰面积、峰裂分（s、d、t、q、m）及偶合常数（?）。
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①化学位移（δppm）：与H核所处的化学环境（H核周围的电子云密度）有关。电子云密度大，处于高场，δ值小；电子云密度小，处于高场，δ值大。
图2-1 常见结构的化学位移大致范围（要求熟记）
~1.8-C=C-CH3 ~0.9-C-CH3 ~2.1-COCH3 ~3.7-OCH3 ~3.0-NCH3 -COOH -CHO Ar-H -C=C-H
(δppm) 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 推断化合物的结构（含H核基团的结构） ②峰面积: 磁等同质子的数目——用积分曲线面积（高度）表示 ③峰裂分及偶和常数：
1
磁不等同两个或两组H核在一定距离内相互自旋偶合干扰，发生的分裂所表现出的不同裂分
峰裂分的数目 峰裂分的距离
符合 n+1 规律 用偶合常数（J）表示 ( n = 磁等同质子的数目 )
不同系统偶合常数 (J Hz) 大小
s 单峰 芳环 J邻6~10Hz d 双峰 J间 0~3Hz t 三重峰 J对0~1Hz q 四重峰 双键 J顺7~11 Hz m 多重峰 J反12~18 Hz
饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小与两个氢原子之间的立体夹角θ有关
O
θ=60 J = 2~4 Hz
O
θ=180 J = 9~10 Hz
环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数
O
Jaa 10~13Hz ( θ=180 )
O
Jae 2~5Hz ( θ=60 )
O
Jee 2~5Hz ( θ=60 ) 1
H-NMR核磁共振辅助技术：
①重氢 (D2O) 交换 —— 推断活泼质子（羟基）的存在与否
②核增益效应（NOE）：指在核磁共振中选择性照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上
接近的另一或数个质子信号强度增高的现象。
③溶剂位移：苯诱导位移 ——由于溶剂分子（苯）的接近，对化合物将发生不同的屏蔽及去屏蔽作用，
使质子化学位移发生变化的现象。
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（2）C-NMR（ 核磁共振碳谱 ）
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FT-NMR: 即脉冲傅里叶变换核磁共振。其装置原理为采用强的脉冲照射使分子中所有的C 核同时发
生共振，生成在驰豫期内表现为指数形式衰减的正弦波信号（自由诱导衰减；FID），再经傅里叶变换即成为正
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常的NMR 信号。随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，C 信号将不断得到增强，噪音则越来越弱。经
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过若干次的扫描及累加计算，最后即得到一张好的NMR谱。 由于该装置的出现及计算机的引入，才使得C-NMR用于有机化合物结构研究成为可能。
信息参数：化学位移（δC）、异核偶合常数（JCH）、驰豫时间（T1） 化学位移：大致范围 (δC ） 0 ~ 200ppm
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不同 C 核δC大小与C 核所处的化学环境（周围电子云密度）有关
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图2-2 主要结构C 核δC的大致范围 ( 要求熟记 )
饱和碳原子（0~60）
150~220( c=o) c=c Ar 50~80 (c-o)
200 150 100 50 0 ( δC ppm ) 13用于C 核类型的推断 13
常用C- NMR测定技术及其特征：
1
①质子宽带去偶（BBO）：也叫全氢去偶（COM）、噪音去偶。采用宽频电磁辐射照射所有H核使之饱和后13
测得的C- NMR谱（即去掉所有氢核对碳核的偶合影响）。
特征：图谱简化，每个碳原子都为单峰，互不重叠。方便于判断碳信号的化学位移。
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伯、仲、叔碳峰增强，季碳为弱峰（照射H核产生NOE效应）。但无法区别碳上连接的H核数目。
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②偏共振去偶：仅保留直接与碳原子相连H核对碳的偶合J CH（即去掉氢核对碳核的远程偶合J CH J CH）。此法现已基本上被DEPT所替代。
特征：伯（-CH3)表现为四重峰（q）；仲（-CH2-) 表现为 三重峰 ( t )；叔（-CH-)表现为双峰( d )；季（-C-）表现为单峰 ( s )。可用于碳核（伯、仲、叔、季）类型的判断。
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③DEPT (无畸变极化转移增强法)：为C- NMR谱的一种常规测定方法。系通过改变照射 H核的脉冲宽度
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（或设定不同的驰豫时间），使不同类型C信号在谱图上呈单峰，并分别呈现正向峰或倒置峰。 特征：脉冲宽度 峰的特征
0
Θ=45 CH3 ↑ CH2↑ CH↑ (↑ 代表正向峰)
0
Θ=90 CH ↑
Θ=135 CH3 ↑ CH↑ CH2↓ （↓ 代表倒置峰）
可用于区别伯（CH3）、仲（CH2）、叔（CH）碳信号；与质子宽带去偶谱比较，还可以确定季碳（-C-）信号。
（3）二维核磁共振谱（2D-NMR谱）
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①同核化学位移相关谱 最常用的是H-H COSY，也称氢-氢位移相关谱，可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。
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②H检测的异核化学位移相关谱 异核化学位移相关谱特别是C-H COSY谱，对于鉴定化合物很重要，常用的有HMQC和HMBC谱。
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HMQC谱能反映H核和与其相连的C的关联关系，以确定C-H偶合关系。
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HMBC谱能把H核和与其远程偶合的C的关联起来。 4．质谱（MS） （1）用途
?确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确到小数点后三位）, 计算分子式。 ?提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离子峰可以确定A-环, B-环的取代模式。 ?与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同条件下，其裂解是符合一定规律的）。 ?依裂解特征及碎片离子 推定或复核未知化合物分子的部分结构。 （2）质谱主要离子源的电离方式及特点：
①电子轰击质谱（EI-MS）：目前常用。但对于热敏成分及难于气化的成分（醇、糖苷、部分羧酸等）、大分子物质（多糖、肽类）难以气化，测不到分子离子峰、亦无法测得分子量。可将此类化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化），制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定。也可采用以下电离新方法。
②化学电离质谱（CI-MS）：通过引入大量的试剂气体产生反应离子与样品分子之间的离子-分子反应，使样品分子实现电离。即使是不稳定的化合物，也能得到较强的准分子离子峰，从而有利于分子量的测定。但此法碎片离子峰少，可提供有关结构信息少。
③场解析质谱（FD-MS）：特别适用于难气化和热稳定性差的固体样品分析，分子离子峰强，但碎片离子
+++
峰较少。为提高灵敏度可加入微量带阳离子K、Na等碱金属化合物于样品中，可产生明显的准分子峰、[M+Na]、
+
[M+K] 和碎片离子峰。
④快原子轰击质谱（FAB-MS）：常用于大分子极性化合物特别是糖苷类化合物的研究。除得到分子离子峰外，还可得到糖和苷元的结构碎片峰，从而弥补了FD-MS的不足。
⑤基质辅助激光解吸电离质谱 ( MALDI-MS )：适用于结构较复杂、不易气化的大分子如多肽、蛋白质的研究，可得到分子离子、准分子离子和具有结构信息的碎片离子。
⑥电喷雾电离质谱（ESI-MS）：一种强静电场的电离技术，既可分析大分子又可分析小分子。可得到样品分子量。
⑦串联质谱（MS-MS）：一种用质谱作质量分离的质谱技术。它可以研究母离子和子离子的关系，获得裂解的信息，用以确定前体离子和产物离子的结构。
5.旋光光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）
在测定手性化合物的构型和构象、确定某些官能团（如羰基）在手性分子中的位置方面有独到之处。 6.X-射线衍射法（X-Ray Diffraction Method）
结晶X-射线衍射法是一种很好的测定化合物分子结构的方法。它测定出的化学结构可能性大，能测定化学法和其他波谱法难以测定的化合物结构。
习题
一、名词解释。 1.PH梯度萃取法 2.盐析法 3.重结晶 4.膜分离法 5.cotton效应 二、选择题
（一）单选题（每题有5个备选答案，备选答案中只有一个最佳答案）。 1. 下列溶剂中极性最强的是
A. Et2O B. EtOAc C. CHCl3 D. n-BuOH E. MeOH 2. 连续回流提取法与回流提取法比较，其优越性是
A.节省时间且效率高 B.节省溶剂且效率高 C.受热时间短 D.提取装置简单 E. 提取量较大
3. 两相溶剂萃取法分离混合物中各组分的原理是
A．各组分的结构类型不同 B. 各组分的分配系数不同
0
C．各组分的化学性质不同 D. 两相溶剂的极性相差大 E．两相溶剂的极性相差小 4．原理为氢键吸附的色谱是
A. 离子交换色谱 B. 凝胶过滤色谱 C. 聚酰胺色谱 D. 硅胶色谱 E. 氧化铝色谱 5．中性醋酸铅可以沉淀的成分是
A. 酚羟基 B. 醇羟基 C. 对二酚羟基 D. 邻二酚羟基 E. 邻二醇羟基
6．硅胶或氧化铝吸附薄层色谱中的展开剂的极性如果增大，则各化合物的Rf值 A. 均变大 B. 均减小 C. 均不变 D. 与以前相反 E. 变化无规律 7．核磁共振氢谱中， δppm值的范围为
A. 0～1 B. 2～3 C. 3～5 D. 5～9 E. 0～10
（二）多选题（每题的备选答案中有2个或2个以上正确答案，少选或多选均不得分）。 1．属于植物二次代谢产物的是
A. 生物碱 B. 萜类 C. 苯丙素类 D. 甾类 E. 蛋白质 2．常见的复合生物途径有
A. 醋酸-丙二酸----莽草酸途径 B. 醋酸-丙二酸----甲戊二羟酸途径 C. 氨基酸----莽草酸途径 D. 氨基酸----醋酸-丙二酸 E. 氨基酸----甲戊二羟酸途径 3．可以与水任意混溶的溶剂是
A．乙酸乙酯 B．甲醇 C．正丁醇 D．乙醇 E．丙酮 4．提取分离中药有效成分时不加热的方法是
A. 回流法 B. 渗漉法 C. 盐析法 D.透析法 E. 升华法 5．关于吸附色谱，说法正确的是
A. 活性炭为非极性吸附剂，在水中对非极性化合物表现强的吸附能力 B. 氧化铝、硅胶为极性吸附剂，对极性化合物吸附力较强
C. 聚酰胺色谱原理为氢键吸附，属于半化学吸附，主要用于酚、醌、黄酮类化合物的分离 D. 硅胶为弱酸性吸附剂，对生物碱的吸附为化学吸附 E. 活性炭、硅胶、氧化铝吸附为物理吸附 6．关于聚酰胺色谱吸附规律
A. 酚羟基数目越多，吸附能力越强 B. 易形成分子内氢键者，吸附力减弱 C. 芳香化程度越高，吸附力越强
D. 聚酰胺对化合物的吸附力在水中最强，在醇中减弱，所以常以不同浓度乙醇为洗脱剂 E. 酸、碱可以破坏聚酰胺对溶质的吸附能力，故可用于聚酰胺的精制及再生处理 7．关于凝胶滤过色谱的叙述，正确的是 A. SephadexG型适宜在水中溶胀应用
B. SephadexLH-20型在水、亲水性有机溶剂或二者组成的混合溶剂中都可以应用 C. 分离原理主要为分子筛
D. SephadexG主要用于多糖、蛋白质的分离，SephadexLH-20适于不同类型有机物的分离 E. 可以再生利用
8．氢谱在化合物结构测定中的应用是
A．确定分子量 B．提供分子中氢的类型和数目 C．判断分子中的共轭体系
D．提供分子中氢的相邻原子或原子团的信息 E．通过加入诊断试剂推断取代基的类型、数目 9．质谱（MS）在化合物结构测定中的应用是
A．测定分子量 B. 确定官能团 C. 推算分子式 D．根据裂解峰推测结构式 E. 判断是否存在共轭体系
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10．属于C-NMR谱类型的是
A. 噪音去偶谱（全氢去偶 COM） B. 宽带去偶（BBD）
C. 选择氢核去偶谱（SPD） D. 远程选择氢核去偶谱（LSPD） E. DEPT法
三、按极性大小排序，当以硅胶为吸附剂、石油醚-乙酸乙酯（9：1）展开，其Rf值的大小顺序：
CHO OHOH O OCOOCH3OH
A B C D E F G H