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酶的固定化技术及其在食品工业中的应用
摘 要
酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上，酶被限定在一定区域内，但仍保持其原有高效、专一、条件温和的催化功能。固定化酶在生物、医药、农业、食品、化工、能源开发、环境保护等方面得到了广泛应用。本文概述了固定化酶的制备方法及优缺点，总结了固定化酶在食品工业中的最新应用情况，并对其应用前景进行了展望。 关键词:固定化酶；制备；应用；食品工业
Technology of immobilized enzyme and its applications in
food industry
Abstract
Immobilization of enzyme is that enzyme, extracted from organic body, is fixed to a special vector.However,it has its original catalyzing functions with high efficiency, specificity and moderate reaction condition.Immobilized enzyme has been used in biology, medicine, agriculture, food industry, chemical industry, developing of energy source, environment protection and so on. In this paper, preparation methods, advantages and disadvantages of mi mobilized enzyme were introduced. And its applications in food industry were summarized.
Key words :mimobilized enzyme; preparation; application; food industry
酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定地促成某个化学反应而本身却不参加反应，具有反应效率高、条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点。这是任何无机催化剂都无法比拟的优点。但因为酶的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对酸、碱、热及有机溶液容易发生酶蛋白的变性作用，从而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中进行反应，反应以后会残留在溶液系统中不易回收，造成最终产品生化分离提纯操作上的麻烦。加之酶反应只能分批进行，难于连续化、自动化操作，这大大地阻碍了酶工程的发展应用。为克服上述缺点，要将游离酶固定化后进行应用。固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。由于固定化酶的运动被化学或物理的方法限制了，能将其从反应介质中回收，所以它原则上能在批量操作或连续操作中重复使用酶。固定化酶技术是酶工程的核心，它使酶工程提高到一个新水平。固定化酶不仅在食品、化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求[1]。
1.固定化酶研究概况 1.1固定化酶的研究和概念
固定化酶的研究源于80年前，但真正开展大规模研究是从20世纪50年代初开始。1953年，Grubohofer等人将羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶和345酶等结合固定在聚苯乙烯树脂重氮化载体上，实现实验室酶的固定化。1969年，日本人千火田一郎成功地把固定化氨基酰化酶反应应用于L，D-氨基酸的光学拆分上，这是国际上固定化酶应用于连续工业化生产的开端。1973年，千火田一郎等人采用固定化微生物细胞连续生产L-天冬氨酸。我国固定化酶研究开始于1970年，首先是中科院微生物所和上海生化所同时开始了固定化酶研究。此后，许多单位相继进行了固定化酶和固定化细胞的应用研究。近年来，固定化酶在食品、制药、化学分析、环境保护等方面的应用越来越广泛[2]。
酶的固定化就是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合或被载体包埋。因而，固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。 1.2固定化酶性质
固定化酶具有如下性质：酶的稳定性提高、最适pH值改变、酶的活性和催化底物有所变化、最适温度有所提高。酶固定化处理后一般稳定性有较大提高，对温度适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；反应完成后，可通过简单的方法回收酶，酶活力降低不多，这样可使酶重复使用；同时由于酶没有游离到产品中，便于产品的分离和纯化；实现批量或连续操作模型的可能，适于产业化、连续化、自动化生产。 1.3 固定化酶的优缺点[ 3-4]
固定化酶技术是将酶用人工方法固定在特定载体上，进行催化、生产，因而固定化酶一般可以被认为是不溶性酶。与水溶性酶相比，优点如下： (1)易于将固定化酶与底物、产物分开，方便后续的分离和纯化； (2)可以在较长时间内连续生产；
(3)酶的稳定性和最适温度提高，最适pH值改变，对温度和pH值适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶敏感性降低； (4)酶反应条件容易控制；
(5)较水溶性酶更适合于多酶反应； (6)可以增加产物的收率，提高产物质量； (7)酶的使用效率高，使用成本低； (8)适于产业化、连续化、自动化生产。
与此同时，由于酶的分离、固定化处理等原因，固定化酶也具有一些难以避免的缺点：
(1)在固定化过程中，酶活力会损失，尤其是胞内酶，预分离过程使酶活力损失
较大；
(2)生产成本提高，工厂初期投资大；
(3)只能用于水溶性底物，而且较适合于小分子底物，大分子底物基本无法进行反应；
(4)不适宜于多酶反应，部分酶还需要需要辅助因子的协助才可以有效反应。
2. 固定化酶制备方法[ 3-7] 2.1 吸附法
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。吸附法较简便，酶活损失小，但酶与载体作用力小，易脱落。物理吸附法是通过非特异性物理吸附作用，将酶固定到载体表面。载体主要有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、陶瓷、金属氧化物、淀粉、白蛋白、大孔树脂、丁基或己基—葡聚糖凝胶、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。载体包含阴离子交换剂(如DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、TEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等)和阳离子交换剂(如CM-纤维素、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-45、IR-120、IR-200、XE-97、Dowex-50等)两大类。 2.2 包埋法
包埋法可分为网格型包埋和微囊型包埋。包埋法较简单，酶活回收率较高，但发生化学反应时，酶易失活，所以常采用惰性材料作载体;另外，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。网格型包埋是将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂、淀粉、明胶、卡拉胶、火棉胶、胶原、大豆蛋白、壳聚糖、海藻酸钠和角叉菜胶等。微囊型包埋是将酶包埋在高分子半透膜中，载体材料有硝酸纤维素、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙膜、聚酰胺、聚脲等。 2.3 共价结合法
共价结合法包括载体共价结合和非载体共价结合。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱落的优点，但反应条件苛刻、操作复杂、酶活回收率低，甚至酶的底物专一性有时也会发生变化。载体共价结合又可分为两种:一种是先将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生共价偶联反应，常用的载体有多糖类衍生物、氨基酸的共聚体、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乙烯二马来酸共聚体，多孔玻璃、陶瓷、卤乙酰、二嗪基或卤异丁烯基衍生物等；另一种是先在载体上共价连接一个双功能试剂，然后将酶共价偶联到双功能试剂上去，常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、
多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。非载体共价结合又叫交联法，是通过双功能或多功能试剂，使酶与酶之间相交联的一种方法。此法不使用载体，作为交联剂的双功能或多功能试剂有戊二醛、甲苯-2，4-二异氰酸酯、双重氮联苯胺、N，N′-乙烯双马来亚胺、Tris等，其中最常用的是戊二醛。 2.4 结晶法
结晶法是利用酶结晶而实现酶的固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。结晶法提供了非常高的酶浓度，因此提高了单位体积的酶活力，对于活力较低的酶更具优越性；但在循环使用过程中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度逐渐降低。 2.5 分散法
分散法是使酶分散于水不溶相中，从而实现酶的固定化。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将酶干粉悬浮于溶剂中；但如果酶分布得不好的话，会引起传质现象，导致酶活力降低。 2.6 热处理法
热处理法是将含酶的细胞在一定的温度下加热一段时间，使酶固定在菌体内的固定化方法。热处理法只适合热稳定性较好的酶。在加热处理时，要掌握好温度和时间，以免引起酶的变性失活。 2.7 其它方法
2.7.1 纳米技术处理 即将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和生产效率。 2.7.2 超声波处理 利用超声波使高分子主链均裂，产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体来固定酶。
2.7.3 磁处理 磁性体Fe3O4与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧化物)，而具有磁响应性的超细粉末，也可作为磁性载体。磁性载体固定化酶具有磁响应性，可借助外部磁场简便地进行酶回收。 2.7.4 电处理 电聚合物作为酶固定化载体时，特别有利于酶电极类生物传感器的制备，这方面的应用目标主要是生物医学检测。
2.7.5 辐射处理 γ射线引发丙烯醛与聚乙烯膜接枝聚合后，活性醛基可共价固定化葡萄糖氧化酶。CO60辐照冰冻态水溶性单体与酶的水溶液混合体时，将使单体聚合与酶固定化同步完成，其回到常温时，因冰融化而形成的多孔结构非常有利于底物与产物的扩散，并可提高酶的活性。
2.7.6 等离子体处理 用等离子体活化处理聚丙烯膜接枝丙烯酸后，可用于固定化胰蛋白酶，等离子体引发的丙烯酰胺聚合可包埋固定葡萄糖氧化酶。此外，