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限制性内切核酸酶的命名方法 例如EcoRI
E:表示大肠杆菌属名的第一个字母； co:表示种名的前两个字母 R：表示株名；
I:表示该菌种中第一个被分离出的酶。
同裂酶 同尾酶 新裂酶的区别
同裂酶：相同识别位点和切割位点不同但来源不同的酶称为同裂酶。 新裂酶：来源不同相同识别位点但切割位点不同的酶。
同尾酶：来源不同，识别位点不同，切割位点也不同，但产生了相同的粘性末端的酶。
影响限制性内切核酸酶酶活性的因素 a能源分子浓度；
b酶浓度，例如，T4DNA连接酶在连接平末端时酶用量为1~2单位连接效率最高；而在连接粘性末端时酶用量为0.1单位时便能得到最佳的连接效率。 c反应时间;
d反应温度，对DNA连接酶而言，连接粘性末端最适37℃，在此温度下，粘性末端处氢键易遭热破坏降低粘性末端结合的速率；因此，连接粘性末端最佳温度应介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 e作为底物的DNA片段的摩尔比等。
典型酶切反应体系组成
无菌水 14ul 10×buffer 2ul BSA牛血清蛋白（保护酶） 2ul DNA样品0.2-1ug在TE 1ul 保护酶2-10ug 1ul 最终体系 20ul 酶在冰上，最后加入反应中，加入酶前把它们全混匀。酶加样顺序一般为：水+缓冲液+DNA+
酶，以保证酶的活性。
什么是星号活性及其引起因素
星号活性：某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶，在每位同一种DNA片段时 会产生新的酶切微位点而得到不同的酶切片段，这种酶活性则称星号活性。 引起因素：
高浓度的甘油（＞5%） 低离子强度小于25mM 高PH(＞8.0）
乙醇，乙二醇等有机溶剂
Mn2+、Cu2+、Co2+等正离子，与Mg2+竞争
物理图谱physical map （Restriction Maps限制性图谱,) (限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱)。
限制性图谱分布图，顺序，距离 （如图）
常用DNA连接酶的特性
T4DNA连接酶:来源T4噬菌体，粘性末端和平末端都可连接，必须以ATP作为辅助因子 E.coliDNA连接酶:来源于大肠杆菌，只催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接。
连接反应温度16℃
匹配末端连接的方法存在的问题及其解决方案
匹配粘性末端：同一种酶切割，混合在一起，自己发生配对，连接。 I 产生的问题：
a.载体自身环化降低了重组子的效率 b.插入的外源DNA片段有两个方向 解决方法：
a.碱性磷酸酶的处理，去除载体DNA片段的5’磷酸，阻止载体DNA分子的自身环化，从而增加了重组DNA的比率。
b.利用双酶切的方法来实现基因的定向克隆，没有合适的双酶切的位点可以通过加衔接物的方法实现定向克隆。
II 不匹配粘性末端如何进行连接？ a.将粘性末端修饰成平末端。
b.将平末端修饰成互补粘性末端（补平）
III平末端的连接方法（提高平末端的效率） a.T4DNA连接酶连接平末端 提高T4DNA酶的浓度； 提高DNA片段的浓度；
降低ATP浓度，以增强连接物与DNA结合；
加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA静电排斥力； 加入浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化合物三氯化六氨钴等。 b.同聚物加尾法 ccc一般用GC更稳定
c.衔接物连接法 两端平末端，人工合成双链使得一端为平末端，另一端为粘性末端 d.DNA片段接头连接法 接头
它是一类由人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
衔接物
是指用化学法合成的一段由10~12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
Klenow大片段
DNA聚合酶I在枯草杆菌蛋白酶下生成大片段和小片段，，大片段即为klenow片段，是具有3’—5’核酸外切酶活性及聚合酶活性。
末端脱氧核苷酸转移酶的特性
① 合成方向5’→3’
② 合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸，
③ 对dNTP非特异性，任一种都可以作前体物，
④可催化3’－OH末端单链或3’－OH突出的双链， 需要Mg++或Mn++，
⑤ 用Co++代替Mg++作辅助因子，可在平末端 DNA分子上进行末端转移。 用途： ① 给载体或cDNA加上互补同聚物尾，
② 标记DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP 也可催化非放射性标记物参入DNA 3’－末端 ③ 可按底物合成多聚脱氧核苷酸同聚物。
修饰酶： 碱性磷酸酶
将DNA RNA或蛋白质的5”磷酸基团切掉，防止DNA的自身环化和5”末端标记前的去鳞。
多聚核苷酸激酶
将ATP的5’磷酸盐催化转移到DNA RNA的5”端，常用于正向反应，交换反应。 RNA酶A（核糖核酸酶A） a可特意剪切3”末端为嘧啶核苷酸的单链RNA，将RNA降解为3’磷酸化的单核苷酸和低聚核苷酸。
b低盐(0~100mmol/L)可以切割单链\\双链\\杂交双链 c 高盐0.3mol/L只切单链
S1核苷酸酶（Nuclease)的特性
以内切酶方式降解单链DNA及RNA，产生以5”磷酸为末端的产物，双联核苷酸不能被降解，除非是有极高浓度的醇。该酶可以用于去除双链DNA的单链末端、单链DNA的选择性切除和RNA转录图谱。
四
载体:是细菌的DNA，运载外源基因进入宿主细胞，并在宿主细胞内进行复制和