发布时间 : 星期二 文章DNA Marker的实验室制备演讲稿-陶鹏飞更新完毕开始阅读
DNA marker的实验室制备
摘 要：DNA marker是一组分子量大小已知的DNA片段混合物，用于指示核酸电泳中未知样品的分子量大小，能迅速帮助实验人员直观判断DNA样品的大小。本实验采用PCR方法，设计了不同的引物对，以pPIC9k质粒为模板，分别扩增出大小为2.0kb、1.5kb、1.0kb、750bp、500bp、250bp的DNA片段，利用紫外分度光度法测定各PCR产物浓度，按照各条带终浓度为10ng/μl的原则混合，同时添加DNA稳定剂及保护剂，配制成DNA marker；经1%琼脂糖凝胶电泳检测，所制备的DNA Marker与商品化的质量基本相当，条带较为清晰，分布均匀，可用于标志DNA大小，可用于分子生物学试验，尚有待进一步优化配制方法。 关键词：DNA标准；核酸电泳；PCR扩增；保护剂；稳定剂
Abstract: DNA marker is a set of DNA fragments of known molecular weight mixture of DNA electrophoresis is used to indicate the molecular weight of the unknown sample size, laboratory personnel can quickly help determine the DNA samples of the size of the visual. PCR method used in this experiment, the design of different primers to pPIC9k plasmid as a template, amplified by the size of 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp of DNA fragments by UV spectrophotometric determination of indexing The PCR product concentration, in accordance with a final concentration of each principle 10ng/μl mixture, and add DNA stabilizers and protective agent, the preparation of DNA marker; by 1% agarose gel electrophoresis, the preparation of the DNA Marker and commodity of the quality quite clear bands, evenly distributed, the size of total DNA can be used for signs, can be used for molecular biological experiments.
Key words: DNA standard; DNA electrophoresis; PCR amplification; protective agent; stabilizer
自20世纪50年代分子生物学诞生，一直到20世纪70年代基因工程技术出现以来，分子生物学相关技术发展迅速，各种新技术、新方法不断涌现，特别是基因组时代以及后基因组时代高通量手段的出现如基因芯片、SAGE、微卫星DNA、AFLPs、SNPs和RAPDs、基因分型和DNA指纹研究等的应用和开发使得分子生物学领域发生着翻天覆地的变化，且在生命科学、医学等学科得到了广泛应用。
核酸技术是分子生物学技术的关键，凡是涉及到核酸的检测都需要核酸电泳过程。在核
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酸电泳过程中，DNA marker又是必备试剂之一，它能准确判断DNA片段的大小，起到DNA标准参照物的作用。此外，利用特殊制作的DNA marker还能对核酸片段进行定量分析。
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA 分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在凝胶上形成一个DNA 片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。国内市场上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出现，其神秘的面纱正在慢慢退去。目前，DNA分子量标准多是购自生物公司，同时由于其应用的普遍性和必要性，为了节约开支，很多实验室都自己制备常用的分子量标准。
按照DNA分子量标准制备所涉及的关键技术，其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR 扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA（genomic DNA）和人工构建的质粒载体（plasmid）；PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。
限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准：利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点天然的或人为加入的，采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种：天然来源的特种DNA如基因组和人工构建的质粒DNA，人工构建质粒DNA还可分为采用部分酶切的人工构建载体和适用于完全酶切的人工构建载体。这种制备方法周期长，工作量大，费时费力，从质粒扩增到酶切一般需2-3d时间，且由于质粒或噬菌体DNA上的酶切位点为非随机分布，制作的DNA marker片段大小不均，使用不便。
通过PCR扩增制备DNA分子量标准：由于PCR polymerase chain reaction 技术强大的DNA片段的扩增能力，同时Taq DNA聚合酶工程菌株的广为流传，利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如Taq DNA聚合酶，模板DNA，反应Buffer等均可自制。相对价格比较低廉，快速，便捷。该方法又可分为两种方法，单一DNA片段的PCR扩增和多重PCR产物的扩增。
因此，目前商品化的Marker多采用PCR扩增混合法制备。
一 材料和方法
1 材料及试剂
大肠杆菌DH5α，pPIC9k载体，pUC19载体，琼脂糖，PE塑料手套，Taq DNA聚合酶，EcoR I，Xhol I，Sal I，dNTP，6×Loading buffer，溴化乙锭，PCR产物纯化试剂盒等均购自大连宝生物有限责任公司。 2 仪器
PCR仪（Model MG96+，杭州郎基科学仪器有限公司）；电泳仪（DYY-11型，北京市六一仪器厂）；离心机（TGL-16B，上海安亭科学仪器厂）；移液枪（10、100、1000μl，Dragon）；恒温培养箱（SPX-100B-Z，上海博迅实业有限公司）。 3 方案 3.1方案一 3.1.1方案设计
将限制性内切酶酶切法与PCR扩增法结合：以实验室所有的pPIC9k载体为模板，设计6条引物，在上游设计一条公共引物，在下游分别设计5条引物。为了便于克隆到载体上，在上游引物设计两个酶切位点，在下游引物上设计一个酶切位点，且设计为同尾酶酶切位点，使PCR产物经内切酶切割后产生相同的粘性末端，便于克隆到载体。 3.1.2引物的设计
上游引物
5'-ATATTCAACGGGAAAC GAATTC CTCGAT 2
下游引物2.0kb 下游引物1.5Kb： 下游引物1.0Kb： 下游引物0.75Kb： 下游引物0.5Kb： 下游引物0.25Kb： 5'-CCACTGGCAGCAGCCA GTCGAC 5'-CTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGC GTCGAC 5'-GACGAGCCAAGGCGATAAATACCCAA GTCGAC 5'-ATTCGGGTAGGAATGGAGCGGGCAAAT GTCGAC 5'-GTGTCTTGAGGTCTCCTATCAGATTA GTCGAC 5'-TCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCG GTCGAC 其中，GAATTC是EcoR I酶切位点，CTCGAT是XholI酶切位点，GTCGAC是Sal I酶切位点。Xhol I内切酶和Sal I内切酶为同尾酶。 3.1.3载体的构建示意图
运用酶切法和PCR法制备DNA标准分子量，根据同尾酶原理，即片段酶切后产生两个相同的粘性末端，在连接上载体质粒后，SalI酶切位点消失而Xhol I酶切位点依然存在（如图1所示）。
PCR模板引物与产物结构
产物经酶消化后产生粘性末端
pUC19载体用XholI酶 消化后产生开环DNA片段
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图1含有不同大小DNA片段重组质粒构建图
经重组质粒转化大肠杆菌，增殖培养后，提取质粒，用EcoR I完全酶切消化，就可获得不同长度的DNA Marker片段。如果结果中250bp与500bp的条带过于暗淡，可以在构建质粒时把250bp与500bp片段多克隆几个到pUC19载体载体上。 3.2方案二 3.2.1方法
利用一对特异的引物和模板（为了提高扩增的效率，模板一般都是某种质粒DNA）。对特异的DNA片段（如500bp）进行分别扩增。这种方法的优点是可以获得任意大小的DNA片段（只要是在PCR技术的可扩增范围之内），同时各种PCR产物可以随意组合,得到各种带型的DNA分子量标准（DNA marker）。在混合过程中，如出现条带亮度降低的情况，可以对产物提高加入终浓度再混合配制。 3.2.2 PCR扩增
2.0kb及1.5kb片段PCR扩增条件为95℃变性2min后，进行PCR循环：94℃ 30s，56℃ l min，72℃min 45s，35个循环，然后72℃延伸10min；1.0 kb及0.75 kb片段PCR扩增条件为95℃ 变性2 min后，进行PCR循环：94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 1min，35个循环，然后72 延伸10min；0.5kb及0.25 kb片段PCR扩增条件为95℃变性2min后，进行PCR循环：94℃ 30s，58℃ 45 s，72℃ 45s。共进行35个循环，然后72℃延伸10min。 3.2.3 产物含量测定
利用紫外分光光度计测定PCR产物OD260，根据1OD相当于50μg双链DNA，计算PCR产物浓度。
3.2.4 DNA marker的制备
按照各条带终浓度为10ng/μl的原则混合，同时添加DNA稳定剂及保护剂，配制成DNA marker。
3.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测制备的DNA marker的质量
配制1%琼脂糖凝胶，点样5μl，电压100V，电泳40min，在紫外灯下观察电泳结果。 二 结果与分析
1 不同大小PCR产物电泳结果 1%琼脂糖凝胶电泳结果如下图：
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