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（一）安装夹心式垂直版电泳槽 各部分依下顺序安装：
装上储槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上；
将长、短玻璃板分别插到硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面，以保持玻璃清洁；
将已插好玻璃板的凝胶模平方在储槽上，短玻璃板应面对上储槽；
将下储槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上储槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽，用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶膜间的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用不连续体系电极缓冲液配制。
（二）配胶及凝胶板的配制 1、配胶
配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。
2、凝胶板的配制
分离胶的制备：
按表配制20mL10%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内，约8cm高，用1mL注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入，约3~4mm高，以进行水封。30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 浓缩胶的制备：
按表配制10mL3%的PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离玻璃板上缘约0.5cm处轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30min后凝胶聚合，再放置20~30min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，将pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下储槽中，应没过短玻璃板0.5cm以上，即可准备加样。 (电极缓冲液即pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%的SDS)
（三）样品的处理与加样 样品的处理：
称取0.5~1mg蛋白质加1mL样品溶解液处理，溶解后，在100摄氏度沸水浴中保
温3min，取出冷却后取样电泳。（如处理好的样品暂时不用，可放在-20摄氏度冰箱内保存，使用前在100摄氏度沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合物。）
加样：
10~15uL(即
（加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为
2~10ug蛋白)；如样品较稀，加样体积可达100uL。如样品槽中有气泡，可用注射器针头跳出。）加样时，将微量注射器的针头穿过电极缓冲液深入加样槽内，应尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。（由于样品溶解液中含有相对密度较大的蔗
糖或甘油，因此，样品溶液会自动沉降在凝胶表面而形成样品层。）
（四）电泳
（分离胶聚合后是否进行预电泳，这应根据需要而定。）
在电极槽中倒入pH值为8.3的Tris-HCl电极缓冲液（内含0.1%的SDS）即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏胶中的pH值环境，预电泳只能在分离胶聚合后进行，应采用分离胶缓冲液。预电泳后，将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续系统，开始时电流为10mA左右；待样品进入分离胶后，改为20~30mA；当燃料前沿距硅胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。
（五）凝胶板的剥离与固定
电泳结束后，取下凝胶膜，卸下硅胶框，用镊子撬开短玻璃板，并切下凝胶板的一角作为加样标志。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。
（六）染色与脱色
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。
（七）绘制标准曲线
将大培养皿放在一张坐标纸上，量出溴酚蓝区带中心距加样端的的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），按下式计算相对迁移率（mR）:
相对迁移率=蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm）/溴酚蓝区带中心加样端的距离（cm）;
Mr=K*10-bm;
lgMr=lgK – b*m=K1 – b*m
Mr为蛋白质的相对分子质量；K,K1为常数；b为斜率；m为迁移率。 （以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得一条标准曲线。）
试剂——
不连续体系有关试剂：
【100g/L的SDS溶液。称取5gSDS，加双蒸水至50mL，微热使其溶解，置于试剂瓶内，于4摄氏度下储存。SDS在低温下易析出晶体，使用前应微热使其完全溶解；
1%（体积分数）的TEMED溶液。量取1mL TEMED，加双蒸水稀释至100mL，置于棕色瓶内，于4摄氏度下储存；
100g/L的AP溶液。称取1g AP，加双蒸水溶解至10mL，最好临用前配制；
样品溶解液（内含2%的SDS、5%的巯基乙醇、40%的蔗糖、0.02%的溴酚蓝的0.01mol/LpH值为8.0的Tris-HCl缓冲液）。先配制0.05mol/LpH值为8.0的Tris-HCl缓冲液：称取0.6gTris,加入50mL双蒸水，再加入约3mL1mol/L的HCl溶液，调整pH值至8.0，最后用双蒸水定容至100mL；
样品溶解液的配置
按表添加各组分：
SDS 巯基乙醇 蔗糖 溴酚蓝 0.05mol/LTris-HCl总体积 缓冲液 200mg 0.5mL 4g 2mg 2mL 10mL 凝胶储液。a.30%的分离胶储液：称取30gAcr及0.8gBis,溶于双蒸水中，定容至100mL，过滤后置于棕色瓶内，于4摄氏度下储存；b.10%的浓缩胶储液：称取10gAcr及0.5gBis,溶于双蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置于棕色瓶中，于4摄氏度下储存； 凝胶缓冲液。a.分离胶缓冲液（3.0mol/L pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液）：称取36.3gTris,加少许双蒸水使其溶解，再加1mol/L的HCl溶液约48mL,调整pH至8.9，最后用双蒸水定容至100mL，于4摄氏度下储存；b.浓缩胶缓冲液(0.5 mol/LpH值为6.7的Tris-HCl缓冲液):称取6.0gTris，加少许双蒸水使其溶解，再加1mol/L的HCl溶液约48mL，调整pH至6.7，最后用双蒸水定容至100mL，于4摄氏度下储存；
电极缓冲液（内含0.1%的SDS的pH值为8.3的Tris(0.05mol/L)-甘氨酸（0.384mol/L）缓冲液）。称取6.0gTris和28.8g甘氨酸，加入10mL 10%的SDS,再加蒸馏水使其溶解，最后定容至1000mL；
1%的琼脂（糖）溶液。称取1g琼脂（糖）于100mL电极缓冲液中，加热使其溶解，于4摄氏度下储存备用。】 固定液。取454mL 50%的甲醇和46mL冰乙酸，混合均匀；
染色液。称取0.125g考马斯亮蓝R250，加250mL上述固定液，过滤后备用； 脱色液。取75mL冰乙酸和50mL甲醇，加蒸馏水定容至1000mL。
仪器——
夹心式垂直版电泳槽，直流稳压电源（300~600V，50~100mA），刻度吸量管（1mL、5mL、10mL），烧杯（25、50、100mL），细长头滴灌，1mL注射器及6号长针头，微量注射器（10或50uL），水泵或油泵（？），真空干燥剂