发布时间 : 星期日 文章2细胞培养及建立泡沫细胞模型更新完毕开始阅读
1)细胞生长贴在玻片上，细胞密度适中，大约60-7_5%满片即可。 2)取出细胞后用4%多聚甲醛固定1 _5分钟，现用现配。 3) PBS冲洗。
4) 0.107oTriton作用20分钟。 5) PBS冲洗。
6) 10%正常血清封闭10分钟。: 7)加入一抗，4度孵育过夜。 8) PBS冲洗4次，各_5分钟。 9)加入荧光二抗，室温30分钟。 10) PBS冲洗4次，各_5分钟。 11) 90%甘油封片。
12)避光保存，荧光显微镜下观察并照相记录。 3)关键技术(详见:2)实验手段)
(1) CaSR的siRNA的设计及转染平台的建立
由于巨噬细胞是终末分化的细胞，转染相对较难。siRNA的转染需要注意如下几点: 工纯化siRNA II避免RNA酶污染III避免使用抗生素W通过看家基因作为 阳性对照优化转染和检测条件。 (2)细胞内游离钙的测定
激光共聚焦显微镜用于细胞内游离钙的测定，由于钙离子探针Fluo-3 /AM是荧光 染料，所以处理后细胞需要避光放置，并减少各组监测时间差，尽量消除染料自身淬灭
而产生的误差。
(3)细胞内胆固醇的测定
细胞内胆固醇的测定需用高效液相色谱，对于这一设备的应用，安静稳定的检测环
境、恒流恒温的流动项对于获得可信的实验结果是必须的。胆固醇检测所需的色谱柱为
Hypersil C 18柱(2.1 mmx150 mm} 3}m)，其运行条件是:流动相:甲醇一水(90:10);流 速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10匹。 2.可行性分析
(1)理论的可行性众多研究业己证明，巨噬细胞的泡沫化和致炎细胞因子的过度释放 在动脉粥样硬化的发生中起关键作用。我们的前期实验结果己揭示CaSR在巨噬细胞有 功能性表达，并且激活后可以促进巨噬细胞细胞因子的释放。可见，我们的假说在理论
上是可行的。
C2)研究方法和实验条件的可行性本项目采用的所有实验手段是国内外研究中广泛
采用方法，技术十分成熟，申请者及其他主要实验者己熟练掌握相关技术。哈尔滨医科
大学病生教研室及基础医学院己具备开展本课题研究所需的实验条件及仪器设备。 (3)研究队伍的可行性本课题组所在研究室在CaSR与心血管相关疾病的研究上居 国内外领先水平。到目前为}卜，我们实验室己经发现CaSR在心肌细胞、血管平滑肌细
胞、肝细胞和巨噬细胞均有表达，在缺血再灌注损伤、心肌肥大、动脉粥样硬化多种病
理过程中发挥重要作用。本课题组成员由具有多年分子生物学和细胞生物学科研经验的
中青年学者组成，前期试验结果己发表SCI论文多篇。 (四)本项目的特色与创新之处。
1.本项目首次在巨噬细胞水平将动脉粥样硬化这一病理过程与CaSR的功能联系起 来，国内外尚未见类似报道。研究结果将从新的视角进一步动脉粥样硬化的发生机制， 为其有效防治提供新思路和新靶点。
2.本试验采用抑制剂的应用与siRNA技术作为平行观察手段，为以上的结论打下夯 实的基础。
(五)年度研究计划及预期研究结果。 1.年度研究计划
1} 2012年1月一2012年12月完成CaSR沉默SiRNA的构建，并建立稳定的转 染平台，完成对在沉默CaSR后THP-1源性巨噬细胞的CaSR活性的检测。 2) 2013年1月一2013年12月完成观察Ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞CaSR 的表达和活性的影响，以及检测CaSR的活化是否影响巨噬细胞泡沫化过程。 3) 2014年1月一2014年6月观察CaSR的活化对泡沫化巨噬细胞合成分泌细胞 因子功能的影响
4) 2014年7月一2014年12月完善研究内容，根据需要补充试验。统计资料， 撰写论文，结题。
2.预期研究结果 (1)研究工作将能够比较系统地阐明CaSR与巨噬细胞泡沫化，以及细胞因子分泌功
能之间的联系，进一步说明CaSR与动脉粥样硬化发生和发展之间的内在联系，从而为 评估CaSR是否可以作为防治动脉粥样硬化一系列疾病的新靶点提供充分的理论基础。 (2)本课题所得研究结果预计在国际杂志(CSCI)发表论文2篇，国内核心期刊发表 论文2篇。
二、研究基础与工作条件 (一)工作基础
1.本课题组对CaSR的研究始于2003年，本与加拿大Wang Rui教授合作，在国际上
首次证明了大鼠心肌有CaSR表达，精胺呈剂量依赖性使细胞内钙增加。在随后的工作 中，我们发现CaSR参与多种心血管疾病的病理过程，如心肌肥大、缺血再灌注损伤、 动脉粥样硬化等，并发表多篇SCI论文。
2. 200_5年以来，本课题组对钙敏感受体在单核巨噬细胞中的作用进行了初步研究， 获得一些有意义结果，其中部分结果己发表论文((SCI收录，详见申请人介绍): 试验结果
1. PMA刺激前后THP-1细胞的生长状态和形态变化
未刺激时，THP-1细胞呈圆形、悬浮生长。PMA刺激24h后，细胞呈贴壁生长，
部分细胞出现伪足，呈扁型虫样;48 h后出现梭型转变，并随着时间的推移，变形 细胞的比例逐渐增高，72h后细胞全部变为贴壁细胞(图6)0 2. CaSR在THP-1细胞中的表达
Western blot结果显示，在THP-1细胞中，PMA诱导前后均有CaSR蛋白的表达， 表现在110, 130kD左右出现2条特异性条带，分别为成熟型和成熟前体CaSR。免疫 荧光染色发现，CaSR蛋白出现在PMA诱导72h后的THP-1细胞的胞浆和胞膜(图7)0