生化基础知识--总结终极版

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不适合,高了会影响其它溶质或产生非特异性聚集影响结果。 透射比浊法

一束强度为Io的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小与光源波长接近)的悬浮液或胶体溶液时,如上图,其透射光强度I可用下式表示:

式中,L为悬浮液或胶体溶液在光前进方向上的长度,τ为浊度系数,与悬浮质点的浓度C成线性关系。令τ=2.3KC,则:

该式与Lamber-Beer定律相似,这是生化分析仪利用透射比浊法进行定量测定的基础,该法可以与吸收光谱法共用一个检测器,所有生化分析仪,不需增加任何部件,均可利用此法进行测定。大部分特种蛋白,如载脂蛋白类(apoAI,apoB等)、补体类(C3、C4等)、免疫球蛋白类(IgG,IgM等)等,配以相应的试剂,可利用此法在生化分析仪上进行测定。 散射比浊法

一束强度为Io的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小远小于光源波长)的悬浮液或胶体溶液时,如上图,与入射光垂直方向上,其散射光强度I可用下式表示:

式中,n1、n2分别表示质点与介质的折射率,ν表示单位体积内的质点数,r表示质点半径。可见散射光强度与悬浮质点的浓度成正比,这是利用散射比浊法进行定量测定的基础,因另需在光路垂直方向上增加一检测器,目前只有极少数生化分析仪可利用散射比浊法进行定量测定,而几乎所有的特种蛋白分析仪、免疫分析仪等都能利用散射比浊法进行定量测定。 1.5. 生化试剂的作用和分类 1.5.1. 生化试剂的作用 a) 显色性

在测定前向血清中加入适当的显色剂(试剂),与待测成分的化学反应使溶液变色即可测定此待测成分。 b) 单一性

不同的试剂和血清中的不同成分反应,引起了吸光度的变化。 1.5.2. NAD+-NADH(NADP+-NADPH)指示系统 1.5.2.1. 反应原理

NADH和NADPH在340nm有特征性吸收峰,而NAD+和NADP+在340nm无特征性吸收峰,利用其偶联的脱氢酶(工具酶)反应,根据340nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活性。

目前利用此指示系统进行测定的临床项目有:ALT、AST、CK、LDH、CK-MB、α-HBDH 、Glu(己糖激酶法)、UREA、NH4+ 、CO2等 1.5.2.2. 举例说明

ALT(GPT)的测定原理(中生试剂,IFCC) 试剂成分和反应公式:

R1: NADH 、乳酸脱氢酶(LDH); R2: L-丙氨酸、α-酮戊二酸。

原理:NADH的减少,引起340nm吸光度的下降,下降速率与ALT活性成正比(动力学法)。

a-HBDH(LDH1)的测定原理(罗氏试剂,DGKC) 试剂成分和反应公式:

R1:磷酸盐缓冲液,a-酮基丁酸,防腐剂; R2:NADH,防腐剂。

原理:NADH的减少,引起340nm吸光度的下降,下降速率与a-HBDH活性成正比(动力学法)。

1.5.3. p-NP和p-NA指示系统 1.5.3.1. 反应原理

p-NP和p-NA在405nm有特征性吸收峰,根据405nm吸光度的变化,可以测定物质的浓度或活。目前利用此指示系统进行测定的临床项目有ALP、ACP、r-GT、AMY等。 1.5.3.2. 举例说明

ALP(AKP)的测定原理(罗氏试剂,IFCC) 试剂成分和反应公式:

R1:AMP缓冲液,镁离子,锌离子,PH=10.44; R2:对硝基苯磷酸,防腐剂,PH=8.5

原理:在镁离子和锌离子的存在下,碱性磷酸酶解离对硝基苯磷酸形成磷酸盐和对硝基苯酚,引起405nm吸光度的上升,上升速率与ALP活性成正比(动力学法)。 GGT的测定原理(罗氏试剂,IFCC) 试剂成分和反应公式:

R1:NaOH,双甘肽,PH=7.7;

R2:L-r-谷氨酰-3-羟基-4-硝基苯氨,防腐剂。

原理:5-氨基-2-硝基苯甲酸的生成,引起405吸光度的上升,上升速率与GGT活性成正比。

1.5.4. H2O2偶联的指示系统 1.5.4.1. 反应原理

H2O2在过氧化物酶的作用下,可使单一个或成对的无色的色素原氧化成有色的色素,导致某一波长吸光度的增加,因此可用来测定物质的浓度或活性。 1.5.4.2. 举例说明

GLU的测定原理(中生试剂) 试剂成分和反应公式: R1:4-氨基安替吡啉、抗坏血酸氧化酶;R2:葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化物酶(POD)、酚。

测定原理:醌亚胺的生成,导致500nm吸光度的增加,增加的程度与Glu的含量成正比。 CHOL的测量原理(德赛试剂) 试剂成分和反应公式:

R1:Good’s缓冲液PH=6.7,苯酚,4-氨基安替比林,CHE(胆固醇脂酶),CHO(胆固醇氧化酶),POD(过氧化物酶)。

测定原理:醌亚胺的生成,导致500nm吸光度的增加,增加的程度与CHOL的含量成正比。

1.5.5. 抗原抗体反应指示系统 1.5.5.1. 反应原理

特异性抗体与抗原(待测物质)在相应的缓冲环境下反应生成抗原抗体复合物,形成一定的浊度,导致特定波长透光率的改变。在抗体过剩的前提下,改变程度与抗原浓度成正比。 目前利用此指示系统进行测定的临床项目有apoAI、apoB、Lp(a)、IgG、IgA、IgM、C3、C4、CRP等。

1.5.5.2. 举例说明(略) 1.5.6. 其它显色反应 1.5.6.1. TP的反应原理

蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物,导致540nm吸光度的增加,增加的程度与蛋白质的含量成正比。

1.5.6.2. ALB的反应原理

在pH4.2环境中,溴甲酚绿在有非离子去垢剂聚氧乙烯月桂醚(Brij-35)存在时,可与白蛋白形成蓝绿色复合物,导致630nm吸光度的增加,增加的程度与白蛋白的含量成正比。

其它的显色反应还有Ca和Mg等物质的测量方法,这里就不一一举例了。 1.6. 常用临床生化项目的主要测定原理和临床意义 项目 测定原理 临床意义

ALT

NADH的减少,引起340nm吸光度的下降,下降速率与ALT活性成正比(动力学法)。 ALT主要存在于肝细胞中,心肌细胞次之,活性升高表示有肝细胞损伤,也可见于心肌及骨骼肌损伤。

AST

NADH的减少,引起340nm吸光度的下降,下降速率与AST活性成正比(动力学法)。 AST主要存在于心肌细胞中,肝细胞次之,活性升高表示有心肌损伤,也可见于肝细胞及骨骼肌损伤。

ALP

对硝基苯酚的生成,引起405nm吸光度的上升,上升速率与ALP活性成正比(动力学法)。 ALP主要存在于骨、肝、肾和肠,活性升高见于肝胆及骨骼疾病等。

r-GT

5-氨基-2-硝基苯甲酸盐的生成,引起405nm吸光度的上升,上升速率与r-GT活性成正比(动力学法)。 活性升高与肝胆疾病、心肌梗塞、脑损伤、慢性酒精中毒、苯妥英钠治疗有关。

α-HBDH

NADH的减少,引起340nm吸光度的下降,下降速率与α-HBDH活性成正比(动力学法)。 活性升高与急性心肌梗塞有关。

LDH

NADH的生成,引起340nm吸光度的上升,上升速率与LDH活性成正比(动力学法)。 活性升高与心肌梗塞有关,也可见于肝脏疾病、未治愈的恶性贫血、巨幼红细胞贫血、肾脏疾病、恶性肿瘤等。

CK

NADPH的生成,引起340nm吸光度的上升,上升速率与CK活性成正比(动力学法)。 活性升高与心肌梗塞有关,也可见于肌营养不良、甲状腺机能减退、肺梗塞、急性脑血管疾病等。

CK-MB 先用CK-M的抗体抑制CK-M的活性,其余同CK的测定 活性升高主要见于心肌梗塞。 α-AMY

1.用生色基团对-硝基酚修饰α-麦芽七糖苷(PNP-G7)作为底物,经α-淀粉酶水解成小分子的寡糖苷,再经辅助酶α-葡萄糖苷酶进一步水解释放出生色基团PNP,导致405nm吸光度增加,增加速率与α-AMY活性成正比, ROCHE公司等采用此法。

2.用生色基团对-硝基酚修饰麦芽五糖苷(PNP-G5)作为底物,其余同1。日本第一化学采用此法,IFCC推荐。

3.采用2-氯-4-硝基苯酚-α-麦芽三糖(CNP-G3)做底物,不需要用辅助酶,直接由淀粉水解产生CNP,导致405nm吸光度增加,增加速率与α-AMY活性成正比,科华采用此法。 活性升高见于急性胰腺炎、胰腺管道阻塞、流行性腮腺炎、细菌性腮腺炎等。

TG

醌亚胺的生成,导致550nm吸光度的增加,增加的程度与TG的含量成正比(终点法)。 升高见于肾病综合症、动脉粥样硬化、甲减、糖尿病、肝病等,降低见于营养不良、β脂蛋白缺乏、甲亢、恶液质等。

TC

醌亚胺的生成,导致550nm吸光度的增加,增加的程度与TC的含量成正比(终点法)。 升高见于动脉粥样硬化、肾病、糖尿病、粘液水肿等,降低见于甲亢、贫血、吸收障碍、恶液质等。

HDL-C 沉淀法:先用磷钨酸钠-镁沉淀LDL-C和VLDL-C,再按TC方法测定。

均相法:先用多聚阴离子化合物选择性遮蔽LDL-C和VLDL-C,再按TC方法测定。 含量越低,发生冠心病的危险越大。 LDL-C 沉淀法:先用PVS沉淀LDL-C,再按TC方法测定,TC值减去该测定值即为LDL-C。 均相法:先用多聚阴离子化合物选择性遮蔽HDL-C和VLDL-C,再按TC方法测定。 含量越高,发生冠心病的危险越大。

UA

醌亚胺的生成,导致550nm吸光度的增加,增加的程度与UA的含量成正比(终点法)。 升高与痛风、白血病、妊毒血症、肾病有关。 UREA 二乙酰—肟法:二乙酰—肟与强酸作用生成二乙酰,二乙酰与UREA在酸性条件下,缩合成红色的二嗪衍生物,导致520nm吸光度的增加,增加的程度与UAEA的含量成正比(终点法)。

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