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第一节 化能异养微生物的生物氧化和产能
生物氧化的形式：包括某物质与氧结合、脱氢和失去电子3种，其过程可分脱氢（或电子）、递氢（或电子）、受氢（或电子）3个阶段；
生物氧化的功能：有产能（ATP）、产还原力（H）和产小分子中间代谢物3种；而生物氧化的类型则包括了呼吸、无氧呼吸和发酵3种。
（1）EMP途径：糖酵解途径，是大多数生物所共有的一条主流代谢途径。
葡萄糖→2丙酮酸+ 2ATP +2NADH +H+C6O12H6+ 2NAD++2ADP + 2Pi 2CH3COCOOH + 2NADH + 2H+ +2ATP + 2H2O
EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径。净生成2ATP。
（2）HMP途径： 又叫戊糖磷酸途径，特点是葡萄糖不经过EMP和TCA循环而得到彻底氧化，并能产生大量NADP+H的形式的还原力以及多种重要的中间代谢产物。 生物化学中解析EMP途径的特点
葡萄糖转化成1，6—二磷酸果糖后，经过醛缩酶的催化，裂解成磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。 3-磷酸甘油醛被进一步氧化生成2分子丙酮酸，
1分子葡萄糖可降解成2分子3-磷酸甘油醛，消耗2分子ATP。2分子3-磷酸甘油醛被氧化生成2分子丙酮酸，2分子NADH2和4分子ATP。
HMP的重大意义：供应合成原料如核酸CoA等原料，其中的赤藓糖-4-磷酸是合成芳香簇、杂环簇氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、和组氨酸）的原料。
（3）ED途径：ED途径不依赖于EMP和HMP途径，是糖类的厌氧降解途径，这是存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中的一种替代途径，为微生物所特有的。也称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径，其特点是葡萄糖只经过4步反应即可获得由EMP10步反应才能形成的丙酮酸。在革兰氏阴性细菌中较多，好氧菌中分布不多。见P112。
（4）TCA循环：广泛存在于各种生物体中重要的生物化学反应，各类好氧微生物中普遍存在。
（5）PK途径：即是磷酸解酮酶途径，磷酸解酮酶有两种，包括戊糖磷酸解酮酶和己糖磷酸解酮酶，常常见于乳酸菌中的肠膜明串珠球菌、短乳杆菌、甘露乳杆菌等采用此途径代谢葡萄糖产生乳酸、乙醇。
三羧酸循环：丙酮酸脱羧生成乙酰CoA，乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸再进入
三羧酸循环。
TCA的结果是乙酰CoA被彻底氧化成CO2和H2O，氧化1分子的乙酰CoA可产生12分子的ATP，草酰乙酸参与反应而本身并不消耗。
乳酸菌糖代谢的特点 对葡萄糖代谢：
同型发酵： C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 2ATP
异型发酵：C6H12O6 1CH3CHOHCOOH +1CH3CH2OH +CO2 + 1ATP 双歧杆菌： C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 3CH3COOH + 2.5ATP 乳糖发酵：
乳糖 C6H12 O6 + 半乳糖 异构化成葡萄糖
第二节 自养微生物的生物氧化
一些微生物可以从氧化无机物获得能量，同化合成细胞物质，这类细菌称为化能自养微生物，它们在无机能源氧化过程中通过氧化磷酸化产生ATP。能进行光能营养的微生物真菌中有藻类及原核生物中蓝细菌。
（1）氨的氧化：NH3和NO2-是可以用作能源的最普通的无机氮化合物，能被硝化细菌所氧化，硝化细菌可分为亚硝化细菌。硝化细菌都是G+细菌，以分子氧作为最终电子受体，而且大多数是专性无机营养型。
（2）硫的氧化：硫杆菌能利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化物作能源。每氧化1 SO32-产生2.5个ATP。
（3）铁的氧化：从亚铁到高铁状态的铁的氧化，对于少数细菌来说也是一种产能反应，但从这种反应中只有少量的能量可以被利用。 （4）氢的氧化：氢细菌都是一些G-的兼性化能自养菌。它们能利用分子氢氧化产生的能量同化CO2，也能利用其他有机物生长。 （5）循环光合磷酸化： 光能营养微生物 （6）非循环光合磷酸化：
（5）循环光合磷酸化：一种存在于光合细菌中的原始光合作用机制，因可在光能的驱动下通过电子的循环式传递而完成磷酸化产能反应。常见的红螺菌目，属于厌氧菌，由于菌体含有菌绿色和类胡萝卜素的量和比例的不同，使菌体呈现出红、橙、蓝绿、紫红、紫或褐等不同的颜色。这是一群典型的水生细菌，广泛分布在缺氧的深层淡水或海水中。由于光合细菌在厌氧条件下所进行的不产氧光合作用可利用有毒的H2S或污水中的有机物（脂肪酸、醇类）作还原CO2时的氢供体因此可用于污水净化。
（6）非循环光合磷酸化：这是各种绿色植物和藻类、蓝细菌所共同的是利用光能产生ATP的磷酸化反应。其特点：电子的传递途径属非循环式的，而且是有氧下进行的。
第三节 能量转换
由上面途径底物脱下的氢通过底物水平的磷酸化和氧化磷酸化将某种物质氧化而释放的能量储存于ATP等高能分子中，对光合微生物而言，则可通过光合磷酸化将光能转变为化学能储存于ATP中。 呼吸——指生物氧化和产能的过程叫呼吸。 （1）氧化磷酸化（有氧呼吸）：物质生物氧化NADH +FADH2电子传递系统将电子传递给分子氧或其他氧化型的物质，偶联ATP的
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合成，产生的能量多。对这类微生物培养要通气培养。终产物为二氧化碳和水。 FMN(黄素单核苷酸) FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸) NADP、NAD(吡啶核苷酸类)： NADP+、NAD+作为脱氢酶的电子受体。 还原型的底物+ NAD+≒氧化型的底物+ NADH+H+
还原型的底物+ NADP+ ≒ 氧化型的底物+ NADPH+H+ （2）底物水平的磷酸化（无氧呼吸）：营养物质生物氧化ATP、GTP。这类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（少数为有机氧化物）的生物氧化，这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。如果无机氧化物充分，产物也能氧化为二氧化碳和水。
需氧微生物——在呼吸过程中，能利用分子氧做为最终电子受体的的生物氧化过程，称为有氧呼吸，这种微生物称需氧微生物。 P104比较有氧呼吸、厌氧呼吸、发酵作用的产能大小。 有氧呼吸：C6H6O6 38ATP
厌氧呼吸：C6H6O6 1796.14KJ 发酵作用：C6H6O6 226KJ
无氧呼吸包括硝酸盐呼吸、硫酸盐呼吸、硫呼吸、铁呼吸等。 （3）发酵作用（fermentation）：广义的发酵最早是指从不断冒泡并产生有用发酵产物的一些自然现象开始的；目前发酵泛指任何利用好氧性或厌氧性微生物来生产有用代谢产物或食品、饮料的一类生产方式。狭义的发酵是指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]经呼吸链传递而直接交中间代谢物，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。 ADP+Pi ATP 无O2下
底物-H 反应物 中间代谢物 中间代谢物-H2 （发酵产物） 发酵的类型很多，食品工业中的发酵常见的如下： 1 乙醇发酵：EMP
C6H12O6 CH3COCOOH CH3CHO CH3CH2OH 2 醋酸发酵： CH3CH2OH CH3CHO CH3COOH
实质是醋酸菌将乙醇在有氧的条件下氧化成乙酸。醋酸菌的种类较多，如纹膜醋酸杆菌、许氏醋酸杆菌等。
3 柠檬酸发酵：关于柠檬酸的发酵，目前大多数的学者认为柠檬酸并非只有TCA循环产生，还可由葡萄糖经EMP途径生存丙酮酸，丙酮酸羧化反应形成草酰乙酸，与乙酰辅酶A形成柠檬酸。
葡萄糖 磷酸稀醇式丙酮酸 草酰乙酸
CO2 柠檬酸 丙酮酸 乙酰辅酶A
4 乳酸发酵：乳酸是乳酸菌发酵的最终产物。乳酸菌的种类有许多，发酵的方式有正型乳酸发酵和异型乳酸发酵两种。 正型乳酸发酵：C6H12O6 +2ADP+2Pi 2CH3CHOHCOOH+2ATP
异型乳酸发酵： C6H12O6 +ADP+Pi CH3CHOHCOOH+ CH3CH2OH +CO2 +ATP，双歧杆菌等还产生乙酸等。 5 核苷酸的发酵: I+G的发酵生产。
6 维生素的发酵：阿舒假囊酵母发酵生产维生素B2。此外还有氨基酸的发酵生产、曲酸的发酵生产、抗生素的发酵生产、酶的抑制剂的发酵生产、各种酶的发酵生产等。
次生代谢产物——微生物在其生命活动中会产生种类繁多的小分子代谢产物，这些代谢产物一般可以分为两类：初级代谢产物和次级代谢产物。初级代谢产物一般属于能量代谢或分解代谢的产物，如乙醇、有机酸、氨基酸等，因此初级代谢产物往往与细胞的生长代谢有着密切的关系。次级代谢产物不是微生物细胞生长所必须的代谢产物，对细胞生长并不具有明显的作用，而且通常以一簇结构相似的化合物组成。它们是微生物细胞正常代谢途径不通畅时增加了支路代谢而产生物质，往往在微生物生长停止后期（即分化期）才开始合成，我们把这些物质叫做微生物的次生代谢产物。
第四节 微生物独特的合成代谢
1 自养微生物的CO2固定： CO2是自养微生物的唯一碳源，异养微生物将CO2作为辅助碳源，将空气中的CO2同化成细胞物质
的过程，称为CO2的固定作用。
自养微生物+ CO2 细胞物质（糖）同化有卡尔文循环、还原性三羧酸循环、还原性的单羧酸循环三个途径。
异养微生物+ CO2 CO2固定在有机物上。因此，异养微生物即使能同化CO2 ，最终必须依靠吸收有机碳化合物生存。 2 生物固氮（biological nitrogen fixation）：
生物固氮——是指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化还原成氨的过程。生物界中只有原核生物才具有固氮能力。生物固氮作用的重要性是地球上仅次于光合作用的生物化学反应，它为地球上整个生物界的生存和繁荣发展提供了不可缺少和持续供应的还原态氮化合物。
固氮的微生物有根瘤菌属、固氮菌属、红螺菌目、甲基球菌科、蓝细菌、以及芽孢杆菌属等。 自生固氮菌：如鱼腥蓝细菌、多粘芽孢杆菌。 固氮菌的分类： 共生固氮菌：如根瘤菌属。
联合固氮菌：必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物，如生脂固氮螺菌、肠杆菌属等。 3 肽聚糖的生物合成：
微生物所特有的结构大分子种类很多，原核生物细胞壁中的肽聚糖、磷壁酸、脂多糖以及壁外的糖被等；古生菌细胞壁中的假肽聚糖等；真核微生物细胞壁中的葡聚糖、甘露聚糖、纤微素和几丁质等。 （1）在细胞质中合成N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸：
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葡萄糖 N-乙酰葡萄糖胺-UDP 葡萄糖 N-乙酰胞壁酸-UDP
（2） N-乙酰胞壁酸合成“Park”核苷酸：N-乙酰胞壁酸 UDP- N-乙酰胞壁酸五肽，分4步完成。P124。 （3）在细胞膜中进行把“Park”核苷酸进一步接上N-乙酰葡萄糖胺和甘氨酸五肽“桥”。形成肽聚糖的单体。经过载体携带到细胞膜外合成肽聚糖。
（4）细胞膜外合成肽聚糖的大分子，由肽聚糖的单体与引物分子间发生反应。
第五章 微生物的生长及其控制
第一节 微生物生长
1 微生物生长的概念：微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、大小）不断地增加，称为微生物的生长现象。生长定义为微生物细胞在群体水平上增加，也可以认为是微生物群体数量增加。许多微生物是以二分裂的方式生长的。一般细胞分裂和染色体复制是协调控制的。单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加，称为繁殖。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。
在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。 生长是细胞逐步发生的量变过程，
繁殖是产生新的细胞个体的质变过程，伴随着细胞总数的增加。 个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖
微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。
测生长量的方法如下：测定生长量的方法有许多种，适用于一切微生物。 2 生长量的测定： 一、直接法
1．测体积 它是一种较为粗放的方法，例如将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
2．称干重 采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10~20%。如用离心法，将待测培养液离心，再用清水洗涤离心1~5次后干燥，可用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。如细菌一个细胞一般重10-12~10-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空干燥（40℃以下），称干重。以乳酸菌为例，在液体培养基中，细胞的浓度大约为2×108个/ ml。100 ml培养物可得10~70mg干重的细胞。 二、间接法
1、生理指标法 与生长量相平行的生理指标很多，它们均可用作生长测定的相对值。
（1） 测定细胞总含氮量来确定细菌浓度 大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量（因其中包括了杂环氮和氧化型氮）的关系可用下式计算： 粗蛋白总量=含氮量%×6.25
含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，主要用于科学研究中。 （2）含碳量的测定 微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质，以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢产物也多。将少量生物材料混入1ml水或无机缓冲液中，用2ml2%重铬酸钾溶液在100℃下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml，在580nm波长下测定光密度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。 （3）其它 磷、DNA、RNA、ATP和 N–乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的测定。
2、比浊法 微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管，用不同浓度的Bacl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，表示10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。
精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的450~650nm波长内均可测定。 三、计数法
计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。 （一）直接法
直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括死细胞在内的总菌数。
1、比例计数法 是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。
2、血球计数板法 计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。 （二）间接法
是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。
1、平板菌落计数法 是一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确，缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长。
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计数的方法 GB方法
培养的温度、时间严格 生长的特殊性
要求计数范围在30—300之间的菌落，当大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘上稀释倍数 呈片状生长的菌落超过培养皿的一半不能计数
当其两个稀释度都在30-300间，二者的比值大于2时，以其中小的数报告 当其两个稀释度的比值小于或等于2时，以应报告其平均数
2、液体稀释法 对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取3ml，接种到3组共9支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（most probable number ，最近似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。 3、细胞混浊度的测定 估计细胞数目和粗重的一较快和适用的方法是使用混浊度测定法。一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现浑浊的，这时因为光线通过悬浮液时，细胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。可以用光度计或分光光度计测量混浊度，分光光度计和光度计射出的光线通过细胞悬浮液时，就可以检测出没有被细胞散射的光线。 3 微生物群体生长的规律
微生物的群体生长规律：单细胞的微生物，如细菌、放线菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会像在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。 （1）典型的生长曲线
微生物生长繁殖的速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约20~30分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的。
在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。如果以培养时间为横坐标，以单细胞增长数目的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。这生长曲线（growth curve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。
根据微生物的生长速率常数（growth rate constant），即每小时的分裂代数的不同，一般把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。 （一） 延滞期（lag phase）
又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期有如下特点：（1）生长的速率常数为零。（2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂做准备。（3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。（4）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。 发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，其方法主要有： （1）以对数期的菌体作种子菌，
（2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素 ，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般
采用3~8%的接种量，最高不超过1/10。
（3）培养基的成分 为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。 （二）对数期（logarithmic phase）
又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generation time）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细胞以惊 16