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在体外亚磷酸甲基化由phpk从北里孢菌属酞嗪
威利亚德？J？维尔纳 凯莉？D？艾伦 胡凯峰 格雷戈里？L？赫尔姆斯 布莱恩？S？陈 和苏珊？C？王
分子生物科学流派、动物医药学院、华盛顿大学，普尔曼，华盛顿99164，美国 在麦迪逊的国际核磁共振设备，威斯康辛大学，麦迪逊，威斯康星，美国 原子核磁共振光谱学中心，华盛顿大学，普尔曼，华盛顿99164，美国 作者贡献
W.J.W. 和 K.D.A. 对此作出同等贡献 摘要
激进腺苷蛋氨酸，依赖性钴胺素，甲基转移酶被提议去催化抗生素合成路线中不起反应的烷基碳和磷。至今，这些酶没有被净化或显现出在体外的活性。这儿，从呔嗪的制造者北里孢菌属呔嗪，我们证明了磷甲基转移酶的活性，PhpK。PhpK催化甲钴胺的甲基集团转移到2-乙酰氨基-4-氢氧磷基丁酮到2-乙酰氨基-4-氢氧甲基磷基丁酮。这一变换是世界上所知的唯一的碳-磷-碳联接。
包含碳-磷-碳联接的化合物常常被用作对抗神经传递素和酶抑制剂。（1）但是这种键合工序只有在自然生产材料和其派生物中被检测到：2-氨基-4-氢氧甲基磷基丁酮，更通常的被认为是1-PT或草铵膦。（2）因为它的结构和谷氨酸相似，1-PT是一个有效的细菌和植物谷氨酸合成酶的抑制剂。(3) l-PT 是一个天然的吸水链霉菌的产物,链霉菌属，北里孢菌属伏杀磷。(4-8)都三个种类通常生产l-pt由于第一一个出口的氨基酸三肽(图表s1)。链霉菌属三肽，或双丙氨膦.
多种的论文审查了遗传学，机械蛋白的酶学在贰链霉菌属路，然而没有的论文特别调查伏杀磷通路。(2，9)没有多少被了解编队的独特c源文件?c源文件秕谷?c源文件c源文件。
以链霉菌属做试验细胞浸膏表明那甲基供体是维他命b12种衍生弥[ch3cbl(iii)尖椒土豆，甲基接者。对应氧膦基三肽。(12)结果产品分别附近的的延期可能基板为日。
计划1。拟议的P -甲基转移反应 序列分析表明，在P -甲基涉及一个公认的甲基对磷霉素（Fom3）和fortimicin（Fms7）的生物合成途径。（10，13）Fom3和Fms7已经推测CH3Cbl催化甲基转移（三）积碳，而不是磷原子（13，14），构成一个耐人寻味机械的问题，在几乎所有情况下，研究，生物转移甲基组通过SN2型发生亲核取代反应（15），因为。没有这种酶家族推测基板的亲核，它可能出现，这些甲基化采用了不同的催化机制。甲基阴离子从CH3Cbl（三）转让的建议，但这种化学是不太可能发生，在水溶液中（12）
2001年，这四个蛋白质被认定为激进的S -腺苷- L -蛋氨酸（SAM）超家族成员（16）自由基的SAM蛋白质包含三个半胱氨酸，通常在一个保守的CXXXCXXC主题，结合[4FE - 4S]集群。减少1状态的集群捐赠电子萨姆，产生的碳 - 硫键的均裂裂解形成催化所需的5' - deoxyadenosyl激进（16）的启示，这些酶是激进的SAM成员超家族的建议的另一个可能的催化，甲基转移机制作为一个激进的（9，17）CH3Cbl（三）在水溶液中的一个有机自由基甲基化化学先例的存在表明，甲基自由基机制是可行的。（18）
为了获得洞察到这组可能激进的SAM甲基，我们选择研究K. phosalacinea帝斯曼43860个P -甲基。测序表明，从光phosalacinea phpK bialaphos生产者，S. viridochromogenes后在大肠杆菌细胞裂解的过度表达（11，19）发表phpK顺序相同的99％以上，PhpK可溶部分中未发现似乎仅在包涵体形式表达。为了净化酶，我们修改iron-sulfur/corrinoid蛋白溶解和复性的文学过程（20）在厌氧室（大队实验室产品）执行所有步骤。复性后，PhpK阴离子交换层析进一步纯化，并假设[4FE - 4S]簇厌氧重组。
PhpK呈黑褐色，并显示紫外可见光谱与其他[4FE - 4S]与局部最大值在420 nm（图S2支持信息）的蛋白质是一致的。（21）铁和硫化物分析表明约5.9摩尔FE和4.4摩尔每PhpK。摩尔小号（22-24）电子顺磁共振（EPR）光谱是用来验证[4FE - 4S]簇（图三的支持信息）的存在。在10 K，一个样本只包含PhpK和缓冲区的EPR谱显示，小G = 2.00信号。除了强烈的化学还原剂，连二亚硫酸钠，导致在一个新的，广阔的克= 1.93符合EPR的活跃，减少[4FE - 4S +集群的光谱特征。假设反应（见下文）所需的所有组件除了[4FE - 4S] +集群消失。
测定活性PhpK是一个重大的挑战，因为缺乏适当的紫外或可见光处理和显著的极性和/或结构相似导致低的色谱分离。也许最重要的，提出的激进的SAM机制可以导致自杀PhpK在体外灭活;理论上陷阱作为基材使用的SAM [4FE - 4S]簇酶2处于非活动状态（9，17）在理论上。多余的连二亚硫酸钠可以激活酶，减少集群[4FE - 4S] +。然而，在实践中，连二亚硫酸钠影响SAM和CH3Cbl（三）存在的副反应。因此，如果单营业额的条件假设，PhpK（61 kDa）的NAcDMPT（209沓）分子的群众之间的差异幅度暗示，将需要观察比较小，微克金额大，金额毫克酶产品。
我们转向核磁共振（NMR）谱，克服这些实验限制。PhpK培养与SAM和连二亚硫酸钠，NAcDMPT（Asischem），CH3Cbl（三），酶的5' - methylthioadenosine nucleosidase（MTAN）（以减轻可能出现的产物抑制）和厌氧培养20 ° C。（25，26）反应混合物变性，PhpK超滤删除。部分纯化及浓缩后，由此产生的物质溶
解在D2O（剑桥同位素实验室）。二维1H - 31P梯度异核单量子相关谱（gHSQC）均录得使用15赫兹的耦合常数。峰位臵略有不同，因为最终pH值和/或光谱仪的差异。NAcDMPT的C - 4的亚甲基质子显示强大的交叉峰在1.38 PPM（1H）和30.0 PPM（31P）由于耦合31P（中四至中七的支持信息的数字）。在上面描述的所有反应组分的存在，催化PhpK NAcDMPT部分转换为NAcPT出现一个新的交叉峰在1.07及44.0 ppm的相应NAcPT甲基组（S5和S6的支持信息的数字表明）。扣球与化学合成NAcPT的样品增加了交叉峰的强度。NAcPT在最后的NMR样品浓度估计为100μM，对应原反应混合物在15-20微米。由于30微米的初始蛋白浓度，这些特定的条件下，PhpK催化单一的营业额。在控制缺乏连二亚硫酸钠，假设是要求减少[4FE - 4S]簇，NAcPT相关gHSQC交叉峰是没有观察到（图支持信息的S4）。因此，我们的研究结果表明，PhpK催化甲基NAcDMPT在一个潜在的激进的SAM依赖性。
为了验证在此反应的甲基组捐助，我们合成13CH3Cbl（三）和一个结合12CH3Cbl（Ⅲ）和13CH3Cbl（三）或13CH3Cbl（三）单独检测PhpK（27）1H - 31P gHSQC混合同位素反应谱显示交叉峰NAcPT甲基质子在1.06和43.8 ppm的支持信息（图七）观察。两个新的交叉峰出现，在0.95和43.7 PPM 1.16和44.1 PPM。在反应混合物含有只13CH3Cbl（三），一个很清晰的独家相关光谱模式的H - P交叉峰（1.15和43.1 PPM为中心，由X表示）（星号表示），是因为观察被动接头1H和31P所附的13C核（图1）。这种模式匹配的额外的混合同位素实验中观察到的交叉峰。一个键J偶合（1JCH）是127赫兹，与预测值相匹配。CH3Cbl（三）在这些条件下，显然作为NAcPT甲基组的唯一来源。（12）同意我们的数据与以前的报告，其中仅用于无细胞提取物CH3Cbl（三）作为最终的L - PT抗生素的直接甲基供体。
图1。H - P gHSQC频谱的部分纯化13CH3 - CBL（三）PhpK反应混合物。该13CH3 H - P交叉峰集中在1.15和43.1 PPM（由X指定）。 总之，我们在体外系统已经建立了一个积极的，一个P -甲基，PhpK研究，广泛适用于有关的酶，包括Fom3和Fms7。我们现正调查PhpK使用一个激进的SAM催化机理的假说，即5' -脱氧腺苷和/或其他SAM裂解产品将提供有力的证据支持激进的机制，（9，17）隔离CBL诱捕（二）。NAcDMPT或肽NAcDMPT - L -丙氨酸- L -亮氨酸的生理底物？另一个问题是CH3Cbl（三）是否是真正的甲基集团捐助，或作为的情况下，在其他CH3Cbl（三） - methylcorrinoid依赖酶，（三）作为辅酶和CH3Cbl CBL功能是否是作为一个甲基化的中间形成。在S吸水以前的工作表明NAcPT甲基组CD3 -蛋氨酸，节约所有三个氘核的起源。，（28），两者合计，这些数据表明，甲基组是从蛋氨酸派生的，是转移到CH3Cbl（三），然后是添加到NAcDMPT由PhpK。CFR和RlmN催化自由基SAM甲基化反应，其中三甲基质子之一是从一个单独的源（29，30）虽然蛋氨酸派生最近的报告形成鲜明对比的是甲基供体，它可以被转换成甲基供体SAM SAM的合成。PhpK可能在依赖CBL -蛋氨酸合成酶中观察到的类似的方式进行还原活化SAM，形成CH3Cbl（三）（17）这里介绍的工作，围绕这一这些和其他有趣的问题的更深层次的机理研究阶段迷人的家庭的酶。 支持信息
实验程序和EPR和NMR谱。这种材料是通过互联网在http://pubs.acs.org负责免费提供。
资金信息
这项研究在麦迪逊（NMRFAM），这是国立卫生研究院（NIH）的资助P41RR02301（BRTP / NCRR）和P41GM66326（NIGMS）。支持的全国磁共振基金的使用附加设备购买资金从美国威斯康星大学，美国国立卫生研究院（RR02781和RR08438），国家科学基金会（NSF）（DMB - 8415048，内审- 9977486，和Bir - 9214394），和美国农业部。华盛顿州立大学核磁共振中心的设备是由美国国立卫生研究院（RR0631401和RR12948），NSF（译文- 9115282和DBI - 9604689），和默多克的慈善信托基金的支持。K.D.A.支持由美国国立卫生研究院培训资助T32GM008336。这项研究是由美国华盛顿州立大学和学院的早期职业发展奖由美国国家科学基金会（职业）SCW（译文0953721）。 返回页首 参考文献 承认
我们感谢他的EPR光谱仪，光谱的收集和解释的援助，和有见地的讨论乔治励博士;肯尼斯约翰逊与EPR技术援助;博士威廉Hiscox核磁共振技术援助;朝晖阳光博士周为MTAN克隆;和Drs。佩里弗雷，基督教惠特曼，和沃尔夫冈Wohlleben见地的讨论。
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这篇文章引用其他出版物30。 1。
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