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Cellular ELISA Protocol
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Nanci Donacki
Contributed by Nanci Donacki
Tue May 14 2002 Wed Apr 28 2004
Formalin Fixed Cell Plates
1. Trypsinize confluent flasks 2. Pool and count cells
3. Centrifuge at 1500 rpm for 10 minutes
4. Resuspend to the appropriate concentration in complete medium
4 x 105 cells/ml for epithelial cells 2 x 105 cells/ml for fibroblast cells 5. Add 100 ?l/cell to 96 well culture plates. 6. Incubate overnight at 37oC. 7. Wash plates twice with PBS
8. Add 125 ?l/well 10% Buffered Formalin 9. Fix for 15 minutes at room temperature 10. Wash three times with di-H2O. 11. Blot dry.
12. Store at 2-8oC.
Reagents
1. PBS:1% BSA 2. PBS:2% BSA 3. Carbonate Buffer
1.59 g Na2CO3 2.93 g NaHCO3
Dissolve in 900 ml di-H2O. Check pH and adjust to 9.6 necessary. Qs. to 1 liter.
4. 10X Substrate Buffer, pH 6.0
36.6 g Citric Acid, monohydrate 113.5 g Potassium dibasic phosphate
Dissolve in 900 ml di-H2O. Check pH and adjust to 6.0 if necessary. Qs. to 1 liter.
5. 0.3% H2O2
Dilute 30% stock Peroxide 1:100 in di-H2O. 6. OPD Stock, 4.0%
4 g OPD in 100 ml di-H2O. Aliquot and store at -20oC. Protect from light.
7. 4.5N H2SO4
12.0 ml Concentrated Sulfuric Acid 88.0 ml di-H2O
Procedure
1. Wash ELISA plates once with di-H2O. 2. Add 250 ?l/well PBS:2% BSA. 3. Incubate 1 hour at 37oC. 4. Wash 3 times with di-H2O.
5. Add 50 ?l/well supe, ascites, or controls diluted in PBS:1%BSA. 6. Incubate for 2 hr at 37oC. 7. Wash 5 times with di-H2O.
8. Add 50 ?l/well anti-mouse IgG:HRP diluted in PBS:1% BSA. 9. Incubate for 1 hr at 37oC.
10. Wash 5 times with di-H2O. Wash once with carbonate buffer. 11. Add 50 ?l/well working substrate solution
0.5 ml 4.0% OPD 5 ?l 30% H2O2
1.0 ml 10X Substrate buffer 8.5 ml di-H2O.
12. Incubate for 20 minutes at room temperature. 13. Add 25 ?l/well 4.5N Sulfuric Acid 14. Read A490
Notes
1. Test all supernatants at 1:5 dilution. 2. Test ascites at 1:100
细胞ELISA实验
一、福尔马林固定细胞
1、用胰蛋白酶消化细胞培养瓶中的细胞； 2、收集细胞并计数； 3、离心，1500rpm，10min；
4、用完全培养基重悬细胞于适当的浓度， 上皮细胞4×105个细胞/ml， 纤维细胞2×105个细胞/ml； 5、滴加到96孔培养板中，100ul/孔； 6、37C环境孵育过夜； 7、用PBS洗板两次；
8、每孔加125ul 10％福尔马林缓冲液； 9、于室温环境下固定15min； 10、用双蒸水洗涤三次； 11、晾干； 12、贮存于2-8 C. 二、细胞
ELISA实验试剂：
1、PBS：1％ BSA 2、PBS：2％BSA 3、碳酸盐缓冲液： 1.59g Na2CO3 2.93g NaHCO3
溶解于900ml双蒸水中，检测并调整pH至9.6，定容至1L； 4、10×底物液，pH6.0 36.6g一水合柠檬酸 113.5g 磷酸氢二钾
溶解于900mL双蒸水中，调pH至6.0，定容至1L； 5、0.3％H2O2：用双蒸水按1：100稀释30％的双氧水
6、OPD贮存液，4.0％：4g OPD溶解于100ml双蒸水，分装后保存到-20 C,注意避光。 7、4.5N H2SO4 12.0mL浓硫酸 88.0ml双蒸水混合 三、实验步骤：
1、用双蒸水洗涤ELISA板两次；
2、每孔加250ul含2％BSA的PBS； 3、37C孵育1h； 4、双蒸水洗板三次；
5、每孔加50ul腹水，上清，或用含1％BSA的PBS稀释后的稀释品； 6、37C孵育2h； 7、双蒸水洗板五次；
8、每孔加50ul用含1％BSA的PBS稀释的HRP酶标抗鼠IgG； 9、37C孵育1h；
10、用双蒸水洗板5次。用碳酸盐缓冲液洗两次； 11、加工作浓度底物液50ul/孔，配方如下： 0.5ml 4.0％ OPD 5ul 30％H2O2 1.0 ml 10× 底物缓冲液 8.5ml 双蒸水
12、在室温下孵育20min； 13、加4.5N 硫酸溶液 25ul/孔； 14、在酶标仪上测OD490波长的值。 注意：
1、检测上清按1：5稀释； 2、检测腹水可按1：100稀释