发布时间 : 星期一 文章生物技术概论基因工程部分复习重点更新完毕开始阅读
1、PCR：一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，d-NTPs、引物和DNA聚合酶，通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使目标DNA得到快速大量的复制，需要两条合成的寡核苷酸片断和耐热的DNA聚合酶。
2、启动子：在基因序列中，标志着转录起始的可以被RNA聚合酶识别的位点（DNA区段），一般位于基因的上游。 3、终止子：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。
4、Ti质粒：根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，约200kb，Ti质粒的结构上可分为毒性区、T-DNA区、结合转移区、复制起始区。
5、SD序列：位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必须，一般长约3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3端互补，控制翻译的起始。
6、反义链：下链或模板链，在基因的DNA双链中，转录时作为mRNA合成模板的那条单链。 7、基因文库：是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。具体来说，构建基因文库时，首先将代表某一生物类型的全部DNA片段分别插入到特定载体上，然后将重组载体导入到宿主细胞并获得大量的含有重组载体的克隆（一般为单菌落或噬菌斑）。
8、DNA探针：经放射性或非放射性物质标记已知的特定的DNA序列。
9、载体构建：用限制性酶切取目的基因，再用同一种限制酶切开质粒，用连接酶把目的基因和质粒连接起来的过程。 10、转化：将普通的质粒分子导入受体细胞的过程。
11、感受态细胞：经过处理后处于容易接受外源DNA状态的细胞。
12、多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。
13、选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因，这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。
14、Cos位点：λDNA为线状双链DNA分子，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过粘性末端形成双链环状DNA分子，这种通过粘性末端互补结合成的双链区段称为cos位点。
15、什么是基因，它和细胞，染色体的关系如何？
DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小的功能单位；基因线性排列在染色体上。
16、为什么认为1973年是基因工程诞生的元年？ 1973年DNA体外重组实验的成功。
17、上世纪40到70年代初分子生物学领域理论上和技术上有哪些重大突破；对于基因工程的诞生起到了决定性的作用？
理论上的三大发现和技术上的三大发明，为基因工程的诞生起到了决定性的作用： 理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质被证实；（2）DNA双螺旋模型被提出；（3）“中心法则”提出
技术上的三大发明：a、核酸限制性内切酶的发现和应用；b、DNA连接酶的发现和应用；c、载体的发现及其应用。
18、什么是克隆？当前动物克隆的基本原理是什么？它和植物的克隆有什么区别？
克隆作为名词是指某一个体(或细胞分子)通过无性繁殖的方式产生的具有相同遗传背景的后代组成的集体。作为动词是指产生上述集体或群体的过程。多利羊的克隆过程：从A羊体中取出卵细胞，去除其细胞核，将B羊的体细胞核取出转移到去和的卵细胞中，然后将整合后的卵细胞注入到C羊的子宫内，经过一段时间得到和A羊几乎相同的羊。植物克隆是利用植物细胞的全能性，进行的营养体的繁殖过程。
19、基因工程的基本流程是什么？基因工程在现实生活中有什么应用价值？ 流程：（1）从供体生物的基因组中，分离获得带有目的基因的DNA片段（2）在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中（3）将重组分子导入到受体细胞中并进行繁殖（4）选择得到含有充足DNA分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使目的基因得到扩增（5）进一步对获得的目的基因进行研究分析，并设法使之实现功能蛋白表达。
应用：基因工程药物、基因疫苗、转基因植物、转基因动物以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保
护等方面。
20、植物转基因育种比常规育种有哪些优势以及转基因育种的不足？ 优势：（1）扩大了基因育种的基因库，打破了常规育种的物种界限（2）提高了作物育种的效率，缩短了育种年限单一性状改良（3）减少了农业生产对环境的污染（4）拓宽了作物生产的范畴。 不足：转基因在技术上比较复杂，要求较高。
21、什么是限制性核算内切酶，怎样命名的？
定义：是一种能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特意的切割双链DNA分子的核酸内切酶。 命名：（1）寄的主菌属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）斜体的略名，表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Eco（2）用一个大写字母表示菌株的类型（3）如果一种特殊的寄主菌株中，具有几个不同的限制修饰体系，则以罗马数字表示该菌株中发现某种酶的先后顺序（4）所有的限制酶除了以上的名称外，前面还冠以系统名称，限制性核算内切酶的系统名称为R，甲基化为M。
22、Ⅱ型限制性核算内切酶的基本特征有哪些？
识别位点的特异性，每种酶都有其特定的DNA识别位点；识别序列的对称性，靶序列通常具有双重旋转对称的结构，呈回交结构；切割位点的规范性，双链DNA被酶切后分布在两条链上的切割位点旋转对称。
23、什么是粘性末端，平末端，同尾酶和同裂酶？
粘性末端：因酶切位点在两条DNA单链上不同的酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的2个粘性末端很同意通过互补碱基的配对而重新连接起来。
平末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。 同尾酶：识别的靶序列不同，但能产生相同的粘性末端的一类限制性核算内切酶。 同裂酶：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。
24、酶的单位如何定义？影响酶活性的因素？
一个酶单位：在理想反应条件下（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃），在20微升反应体系中，1h完全降解1微克DNA所需要的酶量。
影响酶活性的因素：DNA的纯度和甲基化程度；甘油的含量；反应体系中的离子强度；反应体系中的PH值；反应的温度条件。
25、DNA连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何使用价值？
特点：(1)连接的两条链必须分别具有3端自由羟基和5端磷酸基团，而且只有这两个基因彼此相邻才能进行连接反应(2)在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子参加，通常有两种能量分子，ATP和NAD+。用于连接粘性末端和平末端。在平末端DNA片段的末端加尾连接法：（1）末端核苷酸转移酶可以在平端加一些碱基（2）平末端DNA加接头连接法
26、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些不同的酶活力特征？各有何利用价值？ 活性特点及应用：
（1）5‘—3’DNA聚合酶活性，以双链DNA 为模板，催化单个核苷酸结合到引物的3末端并不断延伸。用于DNA连接后的大缺口填充（2）5‘—3’外切酶活性，将双链DNA中游离的5末端逐个切去。用于制备高比活度的DNA探针（3）3‘—5’外切酶活性，将游离的双链或单链DNA的3端降解。用于DNA的序列分析。 27、klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有何异同？
klenow片段是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经过枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子。仍然有5‘—3’聚合酶活性和3‘—5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘—3’的外切酶活性。
28、为何说逆转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，其主要用途是什么？
逆转录酶是一种可以有效地将mRNA转录为DNA的酶，其产物称为cDNA，实际上也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。
（1）有5‘—3’DNA聚合酶活性，能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，后者合成很慢（2）RNA酶活性，能
从5‘或3‘方向特异性降解DNA：RNA杂交分子中的RNA链。
用途：将mRNA转录成cDNA，以制备基因片段。真核生物具有外显子和内含子，用cDNA法可以去掉内含子，用于用于制备基因片段，而原核生物可以直接利用其基因片段。
29、举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要用途。
A、末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶；该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到DNA的3‘ 羟基端，特别是对平末端的双链DNA末端加尾十分有效。最常见的用途是在酶切产生的平末端，以便产生粘性末端。
B、S1核酸酶：在cDNA的合成过程中，切开其发夹结构；载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴。C、碱性磷酸化酶：在用P标记DNA5‘端前，去掉5’端的P，防止载体自身环化，形成二聚体；用于DNA重组技术中，去掉DNA5‘端的P。
30、为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？
催化DNA各种特异性反应的酶是分子生物学家进行DNA操作的基本工具，在分子克隆过程中，制备好目的DNA后，下一布就是使用限制性核算内切酶将待克隆的DNA片段切割下来，与特异性切割的载体在DNA连接酶的作用下连接形成重组分子。这一系列操作不仅用到了限制性核算内切酶和DNA连接酶，而且还需要DNA聚合酶，核酸外切酶，多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶等的参与，以提高特异性DNA片段的连接效率。
31、什么是质粒？其哪些生物学特性对基因工程操作十分有利？
质粒：一种广泛存在于细菌中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA分子。作为基因工程载体，至少应该有复制的起始区，选择表及基因区，多克隆位点。 有利的的生物学特性：①一种广泛存在于细菌中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。②质粒在寄主细胞中“有好地借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存③质粒的复制类型：一种质粒在寄主细胞中存在的称为该质粒的拷贝数④质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同的质粒不能在同一宿主细胞稳定共存，属于同一个不亲和性⑤质粒的存在形式有超螺旋，开环双螺旋，现行双螺旋三种。在琼脂糖凝胶电泳中，不同构性的同一质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前面的是SCDNA，其后依次是LD2NA和OCDNA。
32、λ噬菌体载体和M13噬菌体载体在形态和克隆能力方面有何区别？
λ噬菌体载体由正十二面体的蛋白质头部和中空管状的蛋白质尾部组成。头部包含线状染色体DNA，侵染寄主是将自己的DNA注入到寄主细菌。λ噬菌体载体属于温和噬菌体，LanbdaEHBL载体用来克隆9到23kb的片段，多克隆位点位于stuffer片段的一侧。M13单链DNA的复制型呈双链环形，一般克隆的片段在1kb之内，克隆300~400bp的片段十分稳定。
33、什么是α互补现象？在基因工程中有何利用价值？
大肠杆菌α-半乳糖苷酶可以和底物x-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的α-片段和α-片段分开时就失去了这种显色功能，通常将编码该酶α-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的α-片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的α-片段就能和寄主编码α-片段发生互补并有了对底物X-Gal的作用功能（发生显色反应）。这种显现被称为是alph-complementation 利用价值：所有含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来，因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，分厂容易辨别。然而，不能产生α-片段，从而不会产生蓝色物质，这样可以检测是否插入外源DNA。所需克隆为白色斑点。
34、基因克隆的载体应具备哪些特征？
能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具有多克隆位点而且可携带的外源DNA片段的长度范围较宽；自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。
35、在柯斯质粒载体中，哪些部分是必不可分的？
多克隆位点区，含有cos位点lambdDNA区，复制起始位点和抗性标记区。
36、柯斯质粒载体有何特点？对基因的克隆有何意义？
①具有λ噬菌体的特性，柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞，进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象②具有质粒载体的特性，能像质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便③高容量的克隆能力，用于克隆DNA大片段特别有效。
37、在基因克隆时，我们可以通过哪些途径获得要克隆的DNA片段？
化学法直接合成；从基因组文库中调取；从cDNA文库中调取；通过PCR直接扩增。
38、质粒载体，噬菌体载体，粘粒载体和人工染色体各有何优缺点？ 人工染色体：容量大，遗传稳定，易于操作。
粘粒载体：具有λ噬菌体的体外包装，高效感染等特性，具有质粒载体的易于克隆操作，选择和高拷贝性等特性；具有高容量的克隆能力；具有与同源序列的质粒进行重组的能力。
39、一般来说，人工染色体载体由哪些重要部分组成，其功能是什么？
①着丝粒，主管染色体在细胞分裂过程中正确的分配到各个细胞中②端粒，位于染色体的末端，对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意义③自主复制序列，染色体上DNA复制的起始位点。
40、一般而言，克隆一个基因应该包括哪些必要的步骤？举例说明每一步骤有哪些可供选择的方案。 步骤：目标DNA片段的获得；克隆载体的构建；寄主细胞的转化；重组体克隆的选择鉴定。
举例：以大肠杆菌为例，①DNA片段的获得：限制性内切酶消化，机械切割，双链cDNA的合成，化学法直接合成 ②载体构建：同聚物加尾，粘性末端连接，平末端连接，加接头造成粘性末端 ③细菌转化：重组噬菌体DNA转染，重组质粒的转化，体外包装进行转导 ④重组体的鉴定：表型鉴定，核酸杂交，免疫学分析，酶切鉴定。
41、从基因组文库中获得的DNA片段和从cDNA文库中获得的DNA片段有何差异？
42、简述cDNA文库构建的过程。
提取总RNA；分离mRNA；cDNA合成；cDNA与载体相连；重组子进入细胞中；表达复制。
43、简述菌落原位杂交法筛选含有目标片段克隆的原理。
根据所使用克隆载体的特性不同，重组克隆的方法也多种多样。比如，用噬菌体DNA作为载体时就不需要筛选，所有正常的噬菌斑都是重组体；当使用puc系列载体时，白色菌落一般都是重组体；如果使用的质粒并不具备明显的鉴别特性，那么我们也可以利用DNA的酶切分析进行直接鉴定。比如，从平板上随机挑选10个菌落，然后提取其中的质粒DNA分子并对其进行酶切分析，同样可以准确的选择得到所要的重组克隆，而且同时可以鉴定外源片段插入的方向，选择得到所要的理想克隆。有时，我们不仅想知道哪些是哪些是重组体克隆，而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆。这时我们可以用比较复杂的核酸杂交或免疫化学的方法。
44、作物转基因育种有哪些优势？
a、扩大了作物育种的基因库：转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都可以导入作物培育成具有某些特殊形状的新型作物品种b、提高了作物育种的效率，缩短育种年限，单一性状改良c、减轻了农业生产对环境的污染，可以减少化学杀虫剂对棉衣及天敌的伤害，大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，