发布时间 : 星期二 文章第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体更新完毕开始阅读
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针 *3利用寡核苷酸进行定点突变
2．M13 phage的生物学特性
A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：
① 基因组组织形式相同； ② 病毒颗粒大小、形状相近； ③ DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA)
感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要
衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ蛋白进E.coli细胞内，
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感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。通过?结构进行几轮复制。
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当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。
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E.coli DNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MB DNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3?-CH上合成(+)DNA)。
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当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。
*1.只形成(+)DNA的原理：
当每个感染细胞中合成出200个(+)DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。这种蛋白质通过同(+)链DNA结合，从而阻断了(-)链DNA的合成。
*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面：①阻断GeneIImRNA的转译；
②与新合成的(+)DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。
图 M13 phage在感染的E.coli Cell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RF DNA分子，随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。
因此在感染的细胞内，RF DNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。 D．异常的形态发生(大的克隆能力)
与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。
E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。
每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。
二、M13克隆体系 1．M13克隆体系
A．M13mp载体系列是Messing et al., 构建的。这个载体系列都
是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。
M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有?-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。
B．M13克隆体系的寄主菌
寄主菌的F?因子含有缺陷型的?-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。
这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的?-半乳糖苷酶N端片段与寄主F?因子产生的缺陷型的?-半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。