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实验项目一：常用实验动物的基本操作 （一）实验动物的抓握、固定和处死方法 1、小鼠抓取固定方法
小鼠温顺，一般不会咬人，抓取时先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。有经验者直接用左手小指钩起鼠尾，迅速以拇指和食指、中指捏住其耳后颈背部皮肤亦可。这种在手中固定方式，能进行实验动物的灌胃、皮下、肌肉和腹腔注射以及其他实验操作。如进行解剖、手术、心脏采血和尾静脉注射时，则需将小鼠作一定形式的固定，解剖手术和心脏采血等均可使动物先取背卧位（必要时先行麻醉），再用大头针将鼠前后肢依次固定在腊板上。
2、小鼠的处死方法
可采用颈椎脱臼法。此法是将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。操作时实验人员用右手抓住鼠尾根部并将其提起，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。
（二）动物血细胞计数方法 材料和用品
（1）器材：细胞计数板、细口滴管、绸布。 （2）试剂：0.4％台盼蓝。 （3）材料：血细胞悬液。 实验原理
细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。
细胞计数时，先将培养细胞或血细胞稀释成细胞悬液，然后将细胞悬液滴入细胞计数板内，计数计数板上计数室四大格内的细胞数。根据计数室的容积及稀释倍数，即可计算出细胞浓度。
实验步骤：
图5－1 血细胞计数板
1．采血及稀释 用1ml移液管吸取0.38ml白细胞稀释液放入小试管内备用， 另用5ml移液管吸取3.98ml红细胞稀释液放入小试管内备用。
用酒精棉球消毒兔的耳缘静脉采血部位，用刺血针刺破血管，让血液自然流出，擦去第一滴血，待流出第二滴血时，用一次性毛细血管分2次准确吸取20ul、和20ul，将血液分
别吹入盛有白、红细胞稀释液的小试管内，用滴管放在试管底部轻轻吹出血液，用上清液冲洗毛细取血管2～3次，轻轻摇动，使液体充分混匀。
2. 血细胞计数板的结构
计数板是一块特制的长方形厚玻璃板，板面的中部有4条直槽，内侧两槽中间有一条横槽把中部隔成二长方形的平台（图5-1）。此平台比整个玻璃板的平面低0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间距离（即高度）为0.1mm。平台中心部分各以3mm长，3mm宽精确划分为9个大方格，称为计数室（图5-3），每个大方格面积为1mm3，体积为0.1mm3。四角的大方格，又各分为16个中方格，适用于白细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm3，体积为0.004mm3。每个中方格又各分成16个小方格，适用于红细胞计数。
将盖玻片放在计数板正中，用小吸管吸取摇匀的稀释血液，或者用洁净的玻璃棒，将一小滴血液滴在盖玻片边缘的玻片上，使稀释血液借毛细管现象而自动流入计数室内。如滴入过多，溢出并流入两侧深槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸片把多余的溶液吸出，以深槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，经多次充液，易造成气泡，应洗净计数室，干燥后重做。红细胞和白细胞的计数，各使用一计数室。
3．计数
血液稀释液滴入计数室后，须静置2-3min，然后在低倍显微镜下计数。计数白细胞时，数四角4个大方格的白细胞总数；计数红细胞时，数中央大方格的四角的4个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）的红细胞总数。计数时应循一定的路径，对横跨刻度上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图5-2）。计数白细胞时，如发现各大格的白细胞数目相差8个以上；计数红细胞时，如各中方格的红细胞数目相差20个以上，表示血细胞分布不均匀，必须把稀释液摇匀后重新计数。
图5-2 血细胞计数循径示意图 4．计算
白细胞数：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即得每mm3血内的白细胞总数，因为：
(1)稀释液0.38ml加入血20ul，使血液稀释20倍，换算成未稀释血时应乘以20。 (2)计数四角上4个大方格内的白细胞总数，其容积为1×1×0.1×4=0.4mm3。换算成每mm3时应乘以2.5。这样把4个大方格内数得的白细胞总数乘以50（即20×2.5=50）即为每mm3血内的白细胞总数。
红细胞数：将中央大方格中的5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000，即得每mm3血内红细胞总数。因为：
(1)稀释液3.98ml加入血20ul，使血液稀释200倍，换算成未稀释血要乘以200。
(2)在计数室内只计数0.02mm3（即1个中方格的容积为0.2×0.2×0.1=0.004mm3，5个中方格的容积为0.004×5=0.02mm3），换算成每mm3时应乘以50。
这样把5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000（即200×50=10，000）即得每mm3血液内的红细胞总数。
图5-3 血细胞计数板上计数室的分隔
（三）血红蛋白含量测定的方法
实验原理：实验采用的氰化高铁血红蛋白（HICN）方法是世界卫生组织（WHO）推荐为血红蛋白标准化测定的方法。血红蛋白是红细胞内带氧的色素蛋白，血红蛋白分子含有四个血红素和一个珠蛋白，血红素是一种铁金属复合物，在叶啉环结构中央有一个铁原子，血红素在分子中总量约占4%，并有血红蛋白红色。将一定量的全血与氰化高铁血红蛋白稀释液混合后，红细胞被溶解，血红蛋白释放出高铁氰化钾反应为高铁血红蛋白，再与氰化钾反应为氰化高铁血红蛋白，它是一种稳定的色素，其浓度与吸光值成正比。通过比色法就可以测定血红蛋白的含量。
实验操作步骤：
1、打开血红蛋白测定仪的电源进行预热30分钟。 2、用移液管取5ml文齐氏液放入试管中备用。
3、用酒精棉球消毒手指尖，用消过毒的一次性采血针刺破指尖，用一次性定量毛细管取血20ul。
4、将毛细取血管中的血吹入试管的稀释液中，反复2~3次，充分混匀后放置5~10分钟后备用。
5、仪器调零和校正：预热后，按下测试开关，重复三次吸入稀释液或者蒸馏水调整调零旋钮，使读数为“000”，然后校正。
按下测试开关，吸入已知标准值为100g/L的校正液，调整校正旋钮，使读数显示值与标准值相同，然后弹出测试开关。
6、测试：将吸液管浸到待测试管中的液体中，按下测试开关，吸入待测液体，读取数字，就为待测液中的血红蛋白含量。
注意：
1、吸液过程中避免吸入空气。
2、稀释液中不要出现沉淀，避免堵塞吸管。
3、测试完成后，重复吸入多次蒸馏水冲洗仪器后再关闭电源。 （四）影响血液凝固的因素 【实验目的】
本实验以发生血液凝固的时间为指标，向血液中加入或去掉某些因素或改变某些条件(如温度等)，以观察对血液凝固的影响。 【实验原理】
血液流出血管后很快就会凝固。血液凝固分为内源性凝血系统与外源性凝血系统是指在组织因子的参与下血液凝固的过程。本实验直接从动物动脉放血，由于血液几乎没有和组织因子接触，其凝血过程主要由内源性凝血系统所发动。血液凝固受许多因素的影响，凝血因子可直接影响血液凝固过程。温度、接触面的光滑程度等也可影响血液凝固过程。 【材料与方法】 （一）实验对象 家兔
（二）器材药品 小烧杯、带橡皮刷的玻棒或竹签(或小号试管刷)、清洁试管10支、秒表、水浴装置一套、冰块、棉花、石蜡油、肝素或草酸钾、生理盐水。 （三）方法与步骤
1．动物准备 家兔麻醉后，仰卧固定于兔手术台上，行一侧颈总动脉或股动脉插管，备取血用。
2．试管的准备 取8支干净的小试管，按表8-2准备各种不同的实验条件。
表8-2 影响血液凝固的因素
实 验 条 件 不加其它物质 放棉花少许
用石蜡油润滑试管内表面 保温于37?C水浴糟中 冰水中 加肝素8单位 加草酸钾1-2mg 3．观察项目
(1) 取兔动脉血10ml，注入两个小烧杯内，一杯静置，另一杯用带有橡皮刷的玻棒或竹签(也可用小号试管刷)轻轻搅拌，数分钟后，玻棒或竹签上结成红色血团。用水冲洗，观察纤维蛋白形状。然后比较两杯的凝血情况。
(2) 准备好的每支试管中滴入兔血1ml，观察血液是否发生凝固及发生凝固的时间。 【实验结果】
实验结果(凝血时间)