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生物样品分析中的方法学验证
张剑萍* ,郭澄# (上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海市200233) 中图分类号R927 文献标识码C 文章编号1001- 0408 (2008) 3.- 2469- 03
摘要 目的:介绍在色谱分析方法中方法学验证与质控的内容及其有待发展的方向。方法:参阅国际上有关方法学验证的指导原则、国家食品药品监督管理局管理规范,结合本实验室的标准操作规程,对方法学验证与质控的内容及存在的问题进行综合分析。
结果:总结了方法学验证和质控的内容,及方法学验证中存在的可能的风险。结论:已建立的方法学验证和质控内容基本完善,但方法学验证的标准也应该根据实际情况制定。
关键词生物样品分析;方法学验证;方法学质控
生物样品分析方法的建立、验证和应用是临床前药动学和Ⅰ期临床试验研究中的重要组成部分, 关系到药动学研究和生物等效性试验研究的科学性和正确性。其中, 方法学验证(Met hod validation) 是整个试验数据可靠的基本保证,因此其是各个实验室标准操作规程(SOP) 的重点内容。本文根据国际上有关生物分析方法验证的指导原则, 参照我国国家食品药品监督管理局的管理规范, 结合本实验室研究经验, 总结了以色谱分析方法为主的生物样品分析中方法学验证的内容及其标准制定中有待发展的方向,以供同行交流参考。
1 意义
方法学验证,又称方法学评价、方法学确认等,是整个药动学、生物利用度及生物等效性研究的基础。这是药动学研究有别于其他药理毒理研究的特殊之处。所有药动学研究结果都依赖于生物样品的测定, 只有可靠的方法才能得出可靠的结果。
在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究并建立检测方法学, 以及得到了标准曲线后, 在检测过程中还应进行方法学质控, 制备随行标准曲线并对质控样品进行测定, 以确保检测方法的可靠性。
2 分类及其应用范围
按照美国食品与药品管理局( FDA)分类,方法学验证分为全面验证( Full validation) 、部分验证(Partial validation) 和交叉验证(Cross validation) [1 ]。
2.1 全面验证
对于一个本质上的新药的分析方法, 以及对首次建立的分析方法需要进行全面的分析方法的验证, 对代谢物进行定量分析的时候也要考虑到进行全面的分析方法的验证。
2.2 部分验证
已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证, 部分验证的内容可以根据分析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的分析方法的考察,实际操作中要结合实际情况,以达到客观、严谨的科研目的,确定部分方法学验证的内容。部分方法学验证经常见于如检测方法的改变; 血浆样品采集中抗凝剂的改变; 同一种属的生物基质变化(例如人的血浆改变为人的尿液) ;同一基质的不同种属变化(例如大鼠血浆到犬血浆) ; 相关线性浓度范围的变化; 分析仪器或分析软件工作站的改变; 样品采样量的限制而造成的分析方法过程中的变动(例如儿科中的药动学研究) ;联合用药或特殊的代谢产物影响分析方法的选择性而需要调整色谱条件等情况的分析方法。
2.3 交叉验证
比较两个分析方法的验证参数。常用于同一物质的不同分析方法的改变, 如从高效液相色谱法到液质联用的变化或两个及两个以上实验室对同一物质按同一方案进行分析时[2 ]。
3 内容
分析方法中色谱方法比较常用, 在色谱方法中方法学验证有以下内容[1 ,3 ] :
3.1 特异性
特异性(Selectivity) 要求至少6 个不同个体的空白生物样品无干扰, 并要求提供空白生物样品色谱图、空白生物样品加对照物质色谱图、用药后的生物样品色谱图。如果采用内标方法,还需要提供空白生物样品加内标物质色谱图, 以证明内标中所含杂质不干扰待测药物的分析。
3.2 线性
3.2.1 线性范围确定。根据生物样品中药物浓度范围, 确定线性范围。建立标准曲线时应随行空白生物样品, 但计算时不包括该点。标准曲线至少有不包括空白在内的6 个点。定量范围应能覆盖全部待测浓度, 不允许将定量范围外的浓度推算为未知样品的浓度。
3.2.2 相关系数与反算浓度。通过系列浓度的标准生物样品进行测定, 得到浓度与响应值的回归方程。对于标准曲线的要求除相关系数( r) 值大于0.99 外,还要求经标准曲线反算浓度要在真实浓度的±15 %范围内, 标准曲线最高点和最低点在±20 %范围内。为保证生物分析数据的质量, 采用何种算法建立标准曲线尤为重要, 分析方法委员会(Analytical met hodscommit tee) 推荐使用加权回归方程检查标准曲线的线性(Linear range) 。与普通最小二乘法不同的是加权最小二乘法(Weighted least squares) 在回归计算时增加了1 个权重因子W , 采用这种方法计算回归直线的斜率和截距, 可使生物样品的测定结果与理论值的相对偏差在不同的浓度区间内比较均衡[4 ]。对于测定浓度范围特别宽的少数情况下, 可采用不同浓度区间2 条回归直线组合的方法。
3.2.3 标准曲线各个点的取舍。标准曲线的浓度范围和浓度点一经确定, 在每个分析批次(Batch) 中, 不能为了达到以上对于线性的要求而对标准曲线各个组成点作舍弃处理。只有当标准曲线中某点的反算浓度超过真实浓度的15 % , 才能作舍弃处理, 并要保证舍弃后标准曲线至少包括6 个点。标准曲线最高点和最低点不能作舍弃。
3.2.4 最低定量限(LLOQ) 。定量下限是标准曲线的最低浓度点。LLOQ 的确定应该测定至少5 个样品(不包括标准曲线中的最低浓度点) , 保证在真实浓度的80 %～120 %内, 变异系数(CV) 不得超过20 % ,并且信噪比应大于5 。LLOQ 区别于检测限(Detection limit ) , 检测限只要求信噪比为3 。
3.3 精密度与准确度
3.3.1 质控样品浓度确定。一般采用3 个浓度的质控样品,低浓度接近定量下限, 在定量下限的3 倍以内; 高浓度接近标准曲线的上限(一般为高浓度的80 %) ; 中间选择一个浓度, 每一浓度至少5 个样品。目前, 国际杂志上有些论文中质控样品浓度的选择为标准曲线的最低点、最高点和中间浓度。
3.3.2 精密度(Precision) 。用质控样品的批内和批间相对标准差( RSD) 表示, RSD 一般应小于15 % ,在LLOQ 及最高定量限(ULOQ) 附近RSD 应小于20 %。一日内每隔2 h 处理一组低、中、高浓度样品,共处理5 组,来计算日内精密度。获得批间(日间) 精密度应至少连续测定3 个分析批次,一般为5 个分析批次,每个浓度至少测定3 个样品。
3.3.3 准确度(Accuracy) 。指测定生物样品浓度与真实浓度的接近程度,用REC( %) 表示,一般要求应在85 %～115 %内,在LLOQ 及ULOQ 附近REC 应在80 %～120 %内。