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土壤中含淀粉酶细菌的分离
摘 要
本文研究了从土壤中分离含淀粉酶的细菌，并对细菌的生长进行了探究。首先制备两组土壤稀释液，其稀释度从10-2 —10-6，其中一组经过高温灭菌。然后，利用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离纯化该细菌于相应变好的无菌培养皿内，同时倾倒含有淀粉的琼脂培养基约3-5mm。待平板冷凝后，倒置于恒温箱中培养。实验发现不同菌悬液稀释度对细菌菌落的形成没有严格的比例关系。但是，加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例。最后经过微生物的分离，纯化及鉴定，选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。 [关键词]：土壤微生物； 稀释液； 菌种分离； 高温灭菌； 淀粉酶；
前 言
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的的重要场所，也是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化出许多有价值的微生物。
近几十年来，研究工作者对土壤微生物开展多方面的研究，取得了许多可喜的成就，并被广泛用于生产和生活中。本研究是从土壤中筛选可产生淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生的影响。从实验研究的结果可以为工业化大规模生产含淀粉酶微生物及制备酶制剂等领域提供重要的帮助。
2、材料与方法
2.1 材料
称量纸，棉塞，搪瓷缸（1000ml），电炉
2.1.1 培养基配制的材料与试剂
土豆60克、葡萄糖6克、淀粉3克、琼脂粉6克 2.1.2 玻璃器皿
圆底培养皿（10个）、量筒（100ml）、移液管两支（1ml）、试管（10支）、大三角瓶（500ml）、小三角瓶（250ml）、玻璃珠（20粒）、大烧杯。
2.1.3
样品实验室预先准备好土壤25克 2.2 方法
2.2.1 培养基制备 （一）称量
根据用量按比例向滤液中加葡萄糖6克，加淀粉3克，加琼脂粉6克（边加边搅拌）。然后将滤液置于电炉上熔化，熔化过程中需不断搅拌，当滤液熔化完全后，补足所需水分，定容至300ml。
（二）加棉塞
在锥形瓶口塞上棉塞，防止外界微生物进入培养基造成污染。 （三）包扎
棉塞头上包一层报纸，扎紧，就可以灭菌。 2.2.2 细菌分离方法 （一）制备菌悬液
称25克土样，放在225ml水中，振荡10min，静置5min，用吸管吸上层悬液1ml，加入到9ml试管水中，反复吸吹三次，再取1ml于下一试管中，依次进行制备10-2-10-6浓度的菌悬液两组，每组5支试管。
在土壤稀释过程中，应该用一支吸管由浓到稀，稀释到底。 （二）加热处理
其中一组沸水浴5min后取出，另一组不处理。 （三）加培养基
取无菌培养皿10个，分成A和B两组（加热组和不加热组），分别于培养皿底面按稀释度编号，用吸液管先从浓度低的土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按照无菌操作技术加到相应编号的培养皿中。然后倒培养基（不烫手为好），边
倒边摇匀，使稀释的菌悬液与培养基混和均匀，混匀后静置于桌上。
2.2.3 培养方法
带平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养24~48h观察结果。 2.2.4 含淀粉酶细菌的鉴别方法
打开培养皿盖子，将碘液加入到平板中，观察平板中菌落的变化。若菌落周围出现透明圈，即可证明该菌落为含淀粉酶细菌形成的菌落，否则不能证明。
3 结果与讨论
3.1 稀释度对土壤细菌菌落形成的影响
用牛肉膏－蛋白胨培养基分别培养不同稀释度的土壤菌悬液，结果表明（图1） ，A组（未加热）10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度中形成的菌落数分别为A组（不加热）283、116、27、42、18；B组102、53、16、23、9（加热），其相差的倍数分别为A组1.92、4.29、0.64、2.33；B组1.92、3.31、0.70、2.56 即不同菌悬液稀释度之间没有严格的比例关系，其原因可能是随着菌悬液稀释度逐渐增大，营养物质消耗，代谢产物的积累，土壤细菌群体出现竞争抑死亡率和生长
率
不
规
律
。
图1 稀释度对土壤细菌菌落的影响300250200150B组A组菌100500110100100010000稀释度（×10-6）
3.2 土壤中有淀粉酶活性细菌的比例
为了了解土壤中含淀粉酶菌株的比例，选择了牛肉膏－蛋白胨培养基和马铃
薯－淀粉培养基，由于马铃薯－淀粉培养基中只有淀粉为唯一碳源，因此，在该培养基中能生长良好的细菌一般均具淀粉酶活性。试验的结果如表1所示，按照A组（未加热）10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度中的菌落数计算，所采集土壤样品中具淀粉酶活性的细菌比例在10%左右。
表1 稀释度 10-2c 10-3c 10-4c 10-5c 10-6c
土壤中具有淀粉酶活性的细菌 马铃薯-淀粉培养基 16 10 5 7 0
3.3 菌悬液加热处理对淀粉酶活性细菌比例的影响
将菌悬液进行加热100℃处理，然后按常规方法作稀释和培养，结果表明（图2），加热可显著降低菌悬液中的细菌数量，但具有淀粉酶活性的细菌比例由10％提高到30％，加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例，说明高温加热的处理方法可以杀死土壤中的营养细胞，利用芽孢的耐热性助于芽孢细菌的分离这一特点，可以筛选出形成芽孢的细菌种类，同时为细菌的生长解除营养物质消耗的竞争抑制。
含淀粉酶细菌比例（％）
35302520151050常规分离处理方式加热处理图2 菌悬液加热处理对含淀粉酶细菌比例的影响3.4 淀粉酶活性细菌的获得与初步筛选
将在淀粉培养基中生长的细菌菌落分别进行进一步的划线分离，挑取单个生长的菌落接种到试管中保存，然后在含淀粉培养基的培养皿中加入碘液，观察透明圈的大小，初步选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。
结论
本研究从土壤筛选到产生淀粉酶的微生物，并对影响土壤细菌菌落形成因此的因素进行了探究。从观察得到的实验数据可以看出，不同菌悬液稀释度培养的细菌菌落数没有严格的比例关系，同时，还发现加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例。这可能是利用芽孢的耐热性，杀死土壤中的所有营养细胞，在适宜的外界条件下，孢囊可萌发，重新进行营养生长，分离淀粉酶细菌。加热操作解除了不同种异养型微生物之间的相互竞争。虽然土壤细菌菌落的数量减少，但其分泌淀粉酶的细菌的比例增大。经过加热处理分离的菌株可作为一株能产生高活性淀粉酶的细菌，具有易培养，生长周期短，而且它所产生的淀粉酶是一种中性酶，具有反应条件温和的优良特性，因此，在生产实践中具有特殊意义。
参考文献
1. 钱存柔 黄仪秀/微生物实验教程. —北京：北京大学出版社，1999.7 2. 曲音波/微生物技术开发原理. —北京：化学工业出版社，2005.1 3. 沈萍/微生物学（第二版）. —北京：高等教育出版社，2006.5 4. 黄秀梨/微生物学（第二版）. —北京：高等教育出版社，2003,7