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层析技术习题
一、 选择题
1. 层析图是指――――――――――――――――――――――――――――――（ C ） A.某组分的流出曲线 B. 某组分的层析峰
C.整个层析分离过程所得的各组分流出曲线 D.层析分离过程所得的单组分流出体积 2. 在层析技术中，分配系数是指―――――――――――――――――――――（ A ） A. 一种化合物在固相与流动相中的分配达到平衡时的浓度比 B. 二种化合物在固相与流动相中的分配达到平衡时的浓度比 C. 一种化合物在固相与流动相中的分配达到平衡时的质量比 D. 二种化合物在固相与流动相中的分配达到平衡时的质量比
3. 下列哪项不是层析技术中的速率理论指出的影响柱效的因素：――――――――（ D ） A. 涡流扩散 B.分子扩散 C. 传质阻力 D. 理论塔板高度
4. 下列哪项不是吸附层析常用的吸附剂：――――――――――――――――――（ D ） A. 氧化铝 B.硅胶 C.活性炭 D.琼脂糖
5. 凝胶层析分离混合物的基本原理是：―――――――――――――――――――（ B ） A.吸附力差异 B.分子筛作用 C.离子交换 D.配体亲和差异
6. 关于离子交换层析的描述下列哪一项不正确：―――――――――――――――（ B ）
A.离子交换剂通常不溶于水
B.阳离子交换剂常可离解出带正电的基团 C.阴离子交换剂常可离解出带正电的基团 D.阳离子交换剂常可离解出带负电的基团
7. 分离鉴定氨基酸的纸层析属于―――――――――――――――――――――――（D） A、亲和层析 B、吸附层析 C、离子交换层析 D、分配层析
二、 是非题（对的打“√”，错的打“×” ） 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
三、 填空题 1. 2. 3. 4.
柱层析中，当柱长L一定，理论塔板数n愈大，柱效愈 高 。 柱层析法的定量依据是层析峰的 _峰高_ 和 峰面积。
凝胶层析法分离血红蛋白和CuSO4混合液，先流出层析柱的是__血红蛋白___
根据分离的原理不同分类，层析法主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
1
色谱法就是分离有色物质的方法。――――――――――――――――――――（×） 层析法的最大特点是分离效率高，但它只能分离各种性质相类似的物质。―――（×）
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。――――――――――――（√）
分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中分配达到平衡时的浓度比值。―――――――――――――――――――――――――――――――――（√）
迁移率（或比移值Rf）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。―――――――――――――――――（√）
在层析分析中，通常是根据层析峰的位置来进行定性分析，根据层析峰的面积或高度进行定量分析的。――――――――――――――――――――――――――――（√）
凝胶层析只能分离分子量相差悬殊的混合物，如Hb与CuSO4。―――――― （×） 柱层析中，当柱长L一定，理论塔板数n愈大，柱效愈低。――――――――― （×）
5. 6. 7.
凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质与荷电量不同而进行分离的一种层析技术。
一般讲，柱层析加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对
于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。
四、 名词解释
1.
分配系数
是指溶质在相互接触而互不相溶的两种溶剂中的溶解达到平衡时(1分)，该溶质在两相溶剂中的浓度比(1分)。分配系数是代表物质种属的特征常数，是层析法分离纯化生物大分子的主要依据。在层析技术中，分配系数是指一种化合物在固定相与流动相中的分配达到平衡时的浓度比(2分)。
K=CS/C m=物质在固定相的浓度/物质在流动相的浓度 (1分)
2.
Rf=原点至色斑中心的距离 / 原点至溶剂前沿的距离 (3分)
Rf值取决于被分离物质在两相间的分配系数以及两相的体积比。由于两相体积比在同一实验条件下是常数，所以Rf值主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf值也不同。对于某种给定的化合物而言，在标准条件下Rf是常数。(1分) 3.
分子筛
利用具有一定孔径的高分子聚合物制成的、主要用于分离分子量不同
的混合物的实验材料和方法(3分)。如PAGE能使混合物按分子量由小到大依次分离(1分)；而凝胶层析则能使混合物按分子量由大到小先后依次分离(1分)。
4. 5.
保留值(retention value)是表示样品各组分在层析柱中停留时间的长短(保留时间)或组分流出时所需流动相体积的大小(保留体积)。
理论塔板等效高度（height to a theoretical plate,HETP）,当流动相通过柱的一定高度，在离开这段柱时，流动相中某组分的平均浓度与固定相中的平均浓度可以达到分配平衡，完成这一平衡所需要的柱长称为理论塔板等效高度,简称板高，以H表示。 6.
分离度(resolution）——层析分离效能的总指标Rs的定义为：两相邻组份层析峰保留时间之差与两峰基线宽度总和之半的比值，它可在层析图中用下式计算而得：
Rs＝(tR2－tR1)/1/2(Wb1+Wb2)=2⊿tR/(Wb1+Wb2)
Rs定量地描述了混合物中相邻两组份在层析柱中的分离情况。 7.
柱效率：
混合物被分离的程度(1分)及单组分被洗脱的体积(1分)。一般用塔板数n表示(1分)。两组分tR相差越大、峰宽W越小、塔板数n越大、平衡次数越多，柱效率越高(1分)。
组分被分离的程度（Rs）及单组分被洗脱的体积（Wb）。Rs越大，Wb越小，柱效越高。
可用理论塔板数n或有效理论塔板数和有效理论塔板高度来衡量柱效能的高低。对一定的柱长L而言，每达成—次分配平衡所需的理论塔板高度H愈小，理论塔板数n愈大，柱效能就愈高。
当tR2－tR1的值越大(即两组份的保留值差距越大)，Rs值越大，表示出两峰分得越开，柱分离效能越高，反映了层析作用中的热力学过程。
当两峰的峰宽总和越小(即两峰越窄)，Rs值亦越大，两组份分离越好，越集中，表示柱分离效能越高，反映了
2
Rf值
层析定性实验中，比移值(1分)Rf表示：
层析作用中的动力学过程。 8.
理论塔板数n
塔板理论把层析柱比拟成—个分馏塔，由许多塔板组成。在每个塔板上，组分在两相间达成一次平衡。理论塔板数n就是指物质在柱长L的层析柱中可以达成的平衡次数。对一定的柱长L而言，每达成—次分配平衡所需的理论塔板高度H愈小，理论塔板数n愈大，柱效能就愈高，所以，可用理论塔板数n来描述柱的分离效能。
n=L/H
五、 简述题
1. DEAE纤维素离子交换层析分离血清混合蛋白质时，采用梯度洗脱法
有何优点？ 为什么 pH 要由高低到低变化而离子强度要由低到高变化？ 答：DEAE纤维素离子交换层析分离血清混合蛋白质时，采用梯度洗脱法有如下优点：
（1）
梯度洗脱，使洗脱能力持续增强（1分），适用于Dm值相近的各组分的分离（1分）。血清混合蛋白pI有
的比较接近，与交换剂亲和力相近（1分），采用梯度洗脱法可以提高分离效果（1分）。（2）pH 由高低到低变化，正好能使血清蛋白按pI由高到低依次失去电荷（1分）、分子量由大到小相继被洗脱（1分）。（3）离子强度由低到高变化，使竞争性与离子交换剂结合的能力逐步增强（1分），洗脱能力逐步增强，从而使结合到柱上的血清蛋白能按结合力由弱到强逐步被洗脱。（1分）
如果pH由低到高、pI由高低到低变化,所有蛋白质全部被一次性洗脱（1分），达不到分离的目的（1分）。 2. 简述离子交换层析的的原理，并举例说明其在蛋白质分离纯化中的具体应用。
答： 离子交换层析是以离子交换剂为固定相。利用其对需要分离的各种离子结合力的差异而将混合物中的不同离子进行分离的层析技术（2分）。 ．
离子交换剂是一类具有特殊网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物，不溶于水和许多有机溶剂。聚合颗粒中带电荷的酸性或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带相反电荷的离子(反离子)结合。当流动相中存在其带它相反电荷的离子时，就与先结合在固定相交换基闭上的反离子进行交换（1分）。根据可交换离子的性质，离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类。阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。例：
R--SO3H+Na
阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。如： R－N（CH3）3OH+Cl
流动相中，不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上后，可以用提高流动相中的离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的日的（1分）。
二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)常用来分离中性或酸性蛋白质。例如：将血清蛋白质加到DEAE纤维素（二乙氨基乙基纤维素，Diethylaminoethyl Cellulose，简称：DEAE纤维素）离子交换层析柱上，蛋白质分子可与离子交换纤维素之间以离子键结合，其结合能力的大小主要决定于蛋白质分子所带的电荷量（1分）。由于血清各种蛋白质的等电点不同，因而其荷电量不同，与纤维素结合的能力也不同（1分）。应用梯度洗脱法，逐渐改变洗脱液的pH，使吸附在离子交换纤维素上的蛋白质依次失去电荷（1分），并且通过逐步增加流动相的离子强度使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置（1分），从而使血清中的蛋白质分成γ－球蛋白、α－和β－球蛋白、清蛋白几个部分被洗脱下来，以达到分离纯化。（1分）
3
+
－
－ -+
+
-
R-S03Na+H
-++
（1分）
R－N（CH3）3 Cl +OH（1分）
+－－
3. 有一蛋白质混合物，分子量相近，等电点分别为：A=9.7；B＝6.8；C＝4.5；D＝8.5；E＝7.0，在高pH 时加到
DEAE-纤维素离子交换柱上。如果用逐步降低洗脱液 pH的方法来进行洗脱，请指出各蛋白质的洗脱顺序，并说明理由
4. 试列举出三种层析方法，比较其原理和应用范围。
5. 试述离子交换层析法分离血清蛋白质的基本原理。如果将血清蛋白质在高pH 时加到DEAE-纤维素离子交换柱上，
用逐步降低洗脱液 pH的方法来进行洗脱，请指出各蛋白质的洗脱顺序，并说明理由。（白蛋白pI是4.0、α球蛋白pI是4.8～5.06、β球蛋白pI是5.4、γ球蛋白pI是7.1。） 6. 凝胶层析有哪些应用？ 凝胶层析技术的应用： (1）作为分析工具：
分子量相差比较大的混合物可以用凝胶层析进行分析。在凝胶层析的基础上配合使用纸层析或薄层层析技术可以鉴别出各个析离成分。 (2)作为脱盐工具：
高分子(如蛋白质核酸、多糖等)溶液中的盐类杂质可以借助凝胶层析技术将其除去，这一操作称为脱盐，凝胶层析技术脱盐速度快而完全，而且蛋白质、酶类等成分在分离过程不易变性。
葡聚糖凝胶SephadexG-25因流动阻力小交联度适宜，常用于蛋白质溶液的脱盐。
(3)高分子溶液的浓缩：
(4)用于去除热原物质：
热原物质是微生物产生的某些使人发热的物质，如某些多糖蛋白质复合物等，用凝胶处 理去离子水，可以得到适于制备注射剂的无热原质水。 (5)用于测定高分子物质的分子量
用一系列已知分子量的标准样品放入同一凝胶层析柱内，令其在同一条件下进行凝胶层析分离，记下每一种成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内，可得一直线这就是分子量的标准曲线。 (6)用于物质的分离提纯
7. 试分别阐述分配层析和吸附层析法分离鉴定氨基酸的原理和操作步骤。 8. 简述凝胶层析的分子筛效应，并举例说明其在蛋白质分离纯化中的具体应用。
9. 简述凝胶色谱、离子交换色谱及亲和色谱的基本原理，并举例说明其在蛋白质分离纯化中的具体应用。 10. 按层析过程的机理，层析法分哪几类？按层析操作形式不同又分为哪几类？
11. 在pH6.5的谷氨酸和丙酮酸混合液中，加入适量的新鲜猪肝匀浆后于37℃水浴中保温30分钟，煮沸后蛋白质沉
淀，将上清液点在层析滤纸上，用酚水饱和液进行层析，层析结束后用茚三酮显色出现两条带，这两条带各是什么物质：说明原因？
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