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番茄中番茄红素和β－胡萝卜素的提取及含量测定
巴沁乐 陈晟 陈凯杰
（浙江大学农业与生物技术学院，浙江 310058）
摘 要：多酚氧化酶（PPO）普遍存在于植物组织中，组织被匀浆或损伤后，即被活化并催化组织中的多酚氧化产生褐变，给水果加工带来影响。番茄红素是主要存在于番茄、葡萄柚等植物果实中一种类胡萝卜素,是目前自然界中被发现的最强抗氧化剂。分别以邻苯二酚、苯酚、Tricine做底物，在393nm处每隔10s测定吸光度值变化，发现土豆中PPO对邻苯二酚有较强催化活性，而对后两者的催化活性很弱。以邻苯二酚额为底物，在反应液中加入番茄红素，一定程度上抑制了土豆多酚氧化酶活性。 关键词：多酚氧化酶；邻苯二酚；抗氧化；番茄红素
多酚氧化酶（PPO）普遍存在于高等植物组织中，当组织被匀浆或损伤后，PPO即被活化，催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质中的氨基酸残基反应，结果产生黑色素沉淀（褐变），给水果加工和生产带来影响，故寻找一种合适的抗氧化剂十分必要。
番茄红素是一种脂肪烃，属于类胡萝卜素的一种，在分子结构上有11个共轭双键和2个非共轭双键，因此强抗氧化性，有文献报道，其抗氧化能力为维生素E的1000倍，并具有增强免疫、 清除自由基、防治多种癌症等重要的生理功能，成为近年来的研究热点之一。虽然其纯品价格昂贵，但其超强的抗氧化能力使其能以极少用量即能达到理想的抗氧化效果，因此具有作为抗褐变剂被运用于食品生产的潜力。
本文阐述了将从新鲜番茄中提取的番茄红素用于抑制土豆多酚氧化酶活性的探究，并对土豆多酚氧化酶底物专一性做了初步研究。
1 实验部分
1.1 仪器与设备
电子天平；圆底烧瓶；量筒；回流冷凝管；加热套；抽滤装置；分液漏斗；三角漏斗；纱布；锥形瓶（具塞）；层析柱；胶头滴管；紫外分光光度计。 1.2 材料与试剂
新鲜番茄；95%乙醇（AR）；二氯甲烷（AR）；氯仿（CP）；石油醚（AR）；苯（AR）;饱和氯化钠溶液（AR）；中性氧化铝（AR）；无水硫酸钠（AR）；无水硫酸铵（AR）;Tris-HCl缓冲液；Tween-80（AR）; 甘油(AR)；苯酚（AR）;邻苯二酚（AR）;Tricine(AR)。 1.3 实验步骤
1.3.1 番茄红素和β－胡萝卜素提取和分离 1.3.1.1 混合色素的提取
称取新鲜番茄10 g于100 mL圆底烧瓶中，加95％乙醇40 mL，摇匀，装上回流冷凝管，控制温度不超过90度加热回流15min，趁热将溶液倾出，残渣留在瓶内，加入30 mL二氯甲烷，加热回流15 min（控制温度不超过九十度），冷却，将上层溶液倾出抽滤，固体仍保留在烧瓶内，再加10 mL二氯甲烷重复萃取一次。合并乙醇和2次二氯甲烷提取液，倒入分液漏斗中，加5 mL饱和氯化钠
溶液，振摇，静止分层。分出橙黄色有机相，使其流经一个在颈部塞有纱布且在纱布上铺一层2 cm厚的无水硫酸钠的三角漏斗，流入10ml圆底烧瓶，以除去微量水分。
由于所得类胡萝卜素量较少，再称取新鲜番茄20克重复上述操作，并将两次得到的溶液合并。
层析之前，将此溶液在通风橱中用热水浴蒸发至干。 1.3.1.2 层析柱的制备
取一支干燥的层析柱（底部有砂芯层），将其垂直固定于铁架上。加入3ml石油醚检验其下滴速度（全速条件下，以检验砂芯层是否被堵塞），选择一支滴速正常的层析柱。关闭活塞，将氧化铝加入石油醚中，用滴管吸取石油醚和氧化铝，慢慢加入柱内，直至氧化铝最上沿离柱顶1.5cm左右，打开活塞使溶剂缓缓下滴，待溶剂液面下降至刚好与氧化铝表面相切时，关闭活塞，备用。 1.3.1.3 柱层析分离
将粗制的类胡萝卜素溶解于1ml左右的苯中，用滴管在氧化铝表面附近沿柱壁缓缓加入柱中，打开活塞，至有色物料在柱顶刚流干时即关闭活塞。用滴管取几毫升石油醚，沿柱壁洗下色素，并通过放出溶剂至柱顶流干，从而使色素吸附在柱上。然后加大量的石油醚洗脱，黄色的β－胡萝卜素在柱中移动较快，红色的番茄红素移动较慢。收集洗脱液至黄色的β－胡萝卜素从柱上完全除去，然后用极性较大的氯仿作洗脱剂洗脱番茄红素。将收集到的番茄红素在通风橱内用热水蒸发至干。
1.3.2 土豆中多酚氧化酶(PPO)的提取和纯化 1.3.2.1粗酶液的获得
取 15g 马铃薯，加入50mL 缓冲液为50mMpH7.0 Tris-HCl（-20°C预冷）加石英砂 研磨15min。离心7500r/min 20min取上清液，即为PPO的粗酶液。 1.3.2.2硫酸铵分级沉淀
在PPO的粗溶液中加入16.5g硫酸铵使其饱和度达到30%左右进行沉淀，然后再高速离心机中4℃，7500r/min，4°C离心15min，弃去上清。
用Tric-HCl缓冲溶液溶解沉淀，根据溶液体积加入12g硫酸铵，使其饱和度达到50%左右进行沉淀，7500r/min，4°C离心15min，弃去上清。
用Tric-HCl缓冲溶液溶解沉淀，根据溶液体积加入19.5g硫酸铵，使其饱和度达到80%，7500r/min，4℃离心15min，弃去上清。 1.3.2.2 透析
透析袋前处理：剪一段20cm左右的透析袋，在体积分数50%的乙醇中煮沸1h,然后用0.01mol/L碳酸氢钠洗涤两次，用0.01mol/L EDTA洗涤两次，最后用蒸馏水彻底清洗透析袋，置于4°C冰箱预冷。
将沉淀溶于15mlTric-HCl缓冲液中，倒入一段扎紧的透析袋中，将开口扎紧，浸没于4°C预冷的蒸馏水中进行透析，每隔十分钟换一次经预冷的蒸馏水。四十分钟后，取少许酶液，以邻苯二酚为底物检验酶活，发现活性较低，故继续透析，再经过四十分钟后检验知酶活较高，停止透析。 1.3.3番茄红素对多酚氧化酶活性的抑制 1.3.3.1番茄红素的乳化
取甘油与蒸馏水以体积比1：4混合即得水相。取2ml二氯甲烷，加入98ml石油醚,混匀，即得油相。称取0.025gTween-80,定容至100ml,配成0.25mg/mL作为乳化剂。将蒸干的番茄红素溶于1ml左右油相。取0.6mlTween-80，加至5mL
水相，取0.8mL番茄红素溶液加入混合物，室温下温和振荡乳化1.5h后形成均已液体。
1.3.3.2多酚氧化酶（PPO）酶促反应吸光度扫描
取加入了300μL多酚氧化酶液的1.5ml甘油与水（1：4）的混合物，与1000μL邻苯二酚反应，经过四分钟左右发现反应液明显变黄褐色，取此反应液，在300nm~700nm波长范围内扫描吸光度变化。以同样酶促反应体系，加入200μL经乳化的番茄红素溶液，在300nm~700nm波长范围内扫描吸光度变化。
取两次扫描中吸收峰对应波长的平均值393nm作为以下步骤测定酶促反应吸光度的波长。
1.3.3.3多酚氧化酶（PPO）底物的选择
取加入了300μL多酚氧化酶液的1.5ml蒸馏水，分别与1000μL邻苯二酚，1000μL苯酚，1000μLTricine反应，四分钟内在393nm处每隔10s测定吸光度。
取变化吸光度变化最明显的邻苯二酚作为以下步骤中多酚氧化酶的底物。 1.3.3.4 用番茄红素抑制多酚氧化酶活性
取1.5ml甘油与水（1：4）的混合物，与1000μL邻苯二酚，加入200μL经乳化的番茄红素溶液，混匀，再加入了300μL多酚氧化酶液，混匀。将1000μL邻苯二酚加入混合物中反应，五分钟内在393nm处每隔10s测定吸光值度。
2 结果与讨论
2.1多酚氧化酶（PPO）酶促反应吸光度扫描结果 2.1.1 以邻苯二酚为底物在300nm~700nm处扫描
图1 以邻苯二酚为底物的PPO酶促反应体系在300nm~700nm处吸光度扫描
从上图可知，反应进行4min左右时，此体系吸光度峰值所对应的波长为390nm。
2.1.2以邻苯二酚为底物在300nm~700nm处扫描
图2 加入番茄红素情况下酶促反应体系在300nm~700nm处吸光度扫描
从上图可知，反应进行4min左右时，此体系吸光度峰值所对应的波长为396nm
以相同酶促反应体系，分别以苯酚和Tricine为底物，反应10min后，反应液都仍几乎不变色，故初步判断土豆PPO对这两种物质的催化活性很低，尤其对Tricine几乎没有活性。故反应时测吸光度所用的波长为390nm和396nm的平均值，使得以邻苯二酚为底物时酶促反应体系吸光度较大而易于测定。 2.2多酚氧化酶（PPO）底物的选择
2.2.1邻苯二酚与多酚氧化酶（PPO）反应的结果 时间/s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 吸光度 0.443 0.781 0.918 0.963 1.001 1.029 1.050 1.066 1.077 吸光度0 0.338 0.475 0.520 0．558 0.586 0.607 0.618 0.626 的变化 表1以邻苯二酚为底物200s内反应液在393nm处吸光度 时间/s 90 100 110 120 130 140 150 160 170 吸光度 1．085 1.091 1.098 1.103 1.105 1.110 1.114 1.116 1.119 吸光度0.632 0.639 0.644 0．646 0.651 0.656 0.658 0．661 0．664 的变化 续表1.1
时间/s 180 190 200 吸光度 1．122 1.124 1.127 吸光度0.666 0.669 0.672 的变化 续表1.2
以邻苯二酚底物与PPO反应的体系吸光度变化0.70.60.50.40.30.20.10-0.1吸光度变化以邻苯二酚为底物020406080100120140160180200时间/s
图3 以邻苯二酚为底物与PPO反应的体系吸光度变化
以邻苯二酚为底物与PPO发应时，在200s内，一开始吸光度变化率很快，曲线斜率很大，表明此时酶催化反应速度较快，随后曲线变平坦，反应速度变慢，接近200s时吸光度比初始值增加了0.66左右,但从具体吸光度（表1）分析吸光度还有上升趋势。此时从分光光度计中拿出反应液，发现反应液由反应前的无色变黄褐色，这是邻苯二酚在PPO催化下被空气中氧气氧化产生的褐变，吸光度变大说明体系颜色由于产物积累而加深。
时间/s 吸光度 0 10 苯酚与多酚氧化酶（PPO）反应的结果 20 30 40 50 60 70 80 90 0.252 0.254 0.255 0.256 0.257 0.257 0.258 0.259 0.259 0.261