发布时间 : 星期一 文章23 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酵母蔗糖酶的相对 - 北京工业大学更新完毕开始阅读
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
丁洁，臧清，王然，马翌婷，马雪梅*
(北京工业大学，生命科学与生物工程学院，生物化学技术实验室，北京 100022)
摘 要: 采用SDS 抽提法从酵母中提取蔗糖酶，在SDS 摩尔浓度0.5 mmol/L，温度40℃，提取时间10 h，pH值5.5的提取条件下，进行抽提得到粗酶，经质量分数50 %的乙醇分级沉淀、Mono Q 阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。利用考马斯亮蓝法测定不同浓度梯度的标准酵母蔗糖酶溶液的吸光度值，并绘制标准曲线，然后测定酵母蔗糖酶样液的吸光度值，从而得出该蔗糖酶样液的浓度，分别为：A样液279.53 μg /mL； B样液873.18 μg /mL。最后利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定酵母蔗糖酶的相对分子质量是60kDa。 关键词: 酵母蔗糖酶；SDS法提取；考马斯亮蓝法；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
Study on Purification and Properties of Invertase from Yeast
DING Jie, ZANG Qing, WANG Ran, MA Yi-ting, MA Xue-mei*
(Beijing University of Technology, College of Life Science and Bio-engineering, Laboratory of
Biochemical technology, Beijing, China, 100022)
Abstract：The experiment extracted invertase from brewer’s yeast using SDS extraction. Under the condition of the SDS concentration 0.5mmol/L, temperature for 40 ℃, time for 10h, pH value for 5.5 to get coarse enzyme extraction. Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50％ethyl alcohol and Mono Q chromatography. The absorbance of yeast invertase solution can be determined by Coomassie Brilliant Blue, then draw the standard curve of yeast invertase solution so that we can know the concentration of yeast invertase solution: A samples of 279.53 μg /mL, B samples of 873.18μg /mL. The relative molecular mass of the yeast invertase was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
Key words : Yeast Invertase ; SDS Extraction; Coomassie Brilliant Blue; SDS Polyacrylamide gel electrophoresis
作者简介：丁洁(1992一)，女，北京人，学生。
通讯作者：马雪梅，女，教授，致力于病毒性疾病，遗传性疾病、肿瘤相关疾病的诊断等方面的研究工作。E-mail:xmma@bjut.edu.cn
蔗糖酶( Sucrase , EC 3. 2. 1. 26) 又称转化酶( Invertase)。可作用于β-1 ,2 糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1. 36～1. 60 倍，在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法
[1]
。
本文以SDS抽提法从酵母中提取蔗糖酶，
经乙醇分级沉淀、Mono Q 阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。利用标准曲线对其进行浓度分析，最后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的方法得到酵母蔗糖酶的相对分子量。
1材料与仪器
1.1 材料
酵母（市售）。
1.2主要化学试剂和仪器
十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva 公司提供；等电点标准品，Amersham 公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
牛血清蛋白标准溶液、考马斯亮蓝G-250、30%聚丙烯酰胺储存夜、1.5M Tris-HCl、AP、TEMED、溴酚蓝、生理盐水、去离子水、无水乙醇等。
UV22201 型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters 650 型高级蛋白
纯化系统，Waters 公司制造；Phast System 全自动快速水平电泳仪，Amersham 公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco 公司制造；电泳仪，Bio2Rad 公司制造；精密酸度计，Orion 公司制造。
2方法
2.1酵母蔗糖酶的提取与纯化
2.1.1 酵母提纯
酵母离心（8 000 r/min）15 min 后收集菌体。将收集到的菌体用蒸馏水洗涤，离心，再洗涤，重复数次，直到菌体呈白色，倾出上清液，将不含杂质的干净的酵母保存待用。 2.1.2 粗酶液的制备
准确称取离心分离后的酵母10g，加入60mL 0.5mmol的SDS溶液溶解，在pH为5.5、40℃水浴中加热10h后取出，4℃、12000r/min离心15min。清液即为粗制酶液。4℃保存。 2.1.3乙醇分级纯化
在粗酶液中加人乙醇使其质量分数达30％，4℃放置过夜，4℃、12000 r/min离心15 min，取上清液，再追加乙醇使其终质量分数达50％。4℃放置1 h．4℃、12000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用双蒸水溶解，4℃保存。经SDS抽提法提取，质量分数50％的乙醇沉淀所碍的酶液对透析液(pH 7.3、0.05mol/L，Tris-HCl缓冲液)充分透析，所得透析液4℃保存。
2.1.4 MonoQ阴离子交换柱层析
酵母蔗糖酶经上步纯化后，上
MonoQ(10/10)阴离子交换柱(用pH7.3、0.05 mol/L。Tris-HCl缓冲液充分平衡过)，然后用0～l mol/L、60 min线性梯度的NaCl溶液(内含pH 7.3、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱。体积流量为0.5mL/min，每管收集3 mL。，紫外检测波长为280 nm。测定各管洗脱液的蔗糖酶活性与蛋白质含量，合并蔗糖酶活力高的若干管洗脱液，经过对水透析脱盐，冷冻干燥后即为纯化的酵母蔗糖酶。 2.1.5 蔗糖酶活性的测定
稀释酶液0.5 mL，加入0.3 mL pH值为
4.6、0.1 mol/L的NaAc-HAc缓冲液，0.2 mL 0.1 mol/L的蔗糖溶液，37℃准确反应15min后，加0.125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反应。用DNS法在540 nm波长下测定形成的还原糖量。在该条件下，蔗糖酶液1 min转化底物蔗糖生成1μg葡萄糖定义为1个活力单位[2]。
2.2考马斯亮蓝法测定酵母蔗糖酶的浓
度
2.2.1蛋白质标准曲线的绘制
表2.1 蛋白质标准溶液配制表
管号 蛋白质母液/μL 生理盐水/μL 考马斯亮蓝G250/μL
总体系/μL 蛋白质浓度/(μg/mL)
1 0 150.00 2850 3000 0
2 18.75 131.25 2850 3000 100
3 37.50 112.50 2850 3000 200
4 56.25 93.75 2850 3000 300
5 75.00 75.00 2850 3000 400
6 93.75 56.25 2850 3000 500
7 112.50 37.50 2850 3000 600
母液 800
根据表2.1，配制7份梯度浓度的蛋白质标准溶液，室温静置3min，在595nm波长处比色，绘制标准曲线。
2.2.2酵母蔗糖酶样液浓度的测定
取一支干净试管，加入样品液1.0mL及考马斯亮蓝染液4.0mL，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线，即可求出含量。
2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酵
母蔗糖酶的相对分子量
2.3.1 酵母蔗糖酶样品的处理
2.3.1.1 低相对分子质量标准蔗糖酶样品的制备
分装标准蔗糖酶样品，即每个包装加入200 μL去离子水充分溶解，然后分装于200个小塑料离心管。分装后每份体积10 μL，每种标准蛋白质的含量为2μg，-20 ℃保存。用
时加入等体积的样品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。 2.3.1.2 待测蔗糖酶样品的制备
取蛋白样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）1mL溶解。加入等体积的样
品缓冲液，混匀，在沸水浴中加热3min，待电泳时用于上样。 2.3.2 凝胶的制备 2.3.2.1 分离胶的制备
表2.2 10%的SDS-PAGE分离胶6mL体积配方表
试剂
30% 聚丙烯酰胺储存夜
2.4
ddH2O
1.5M Tris-HCl（PH8.8）
1.5
1%SDS
1%AP
TEMED
用量/mL
1.98 0.06 0.06 0.007
根据表2.2，配制分离胶于一烧杯中，混匀，用移液枪将混匀的溶液缓慢沿板角注入两块玻璃板之间，至2/3的位置。注入完毕后，
封上一层水加速聚合，当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 2.3.2.2 浓缩胶的制备
表2.3 5%的SDS-PAGE浓缩胶2mL体积配方表
试剂
30%
聚丙烯酰胺储存夜
0.33
ddH2O 1.4
1.5M Tris-HCl（PH6.8） 0.25
100g/L SDS 0.02
100g/L AP 0.02
TEMED
用量/mL
0.002
用滤纸吸干水后，根据表2.3，配制浓缩胶于一烧杯中，混匀，用移液枪将混匀的溶液缓慢沿板角注入两块玻璃板之间并溢出，迅速插入梳子，待浓缩胶凝固。 2.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
待浓缩胶凝固后，向电泳槽中倒满电泳液，小心地取出梳子，向凹槽中分别注入5μLMarker溶液和5μL加过溴酚蓝指示剂的
蔗糖酶样液。连接好电泳仪后，接通电源，调节电压为50V（约8V/cm），当溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调至120V，待溴酚蓝下行到距胶末1cm停止电泳。 2.3.4 凝胶的染色、脱色及照相
电泳结束后，将凝胶板取下，切去浓缩胶，并进行方位标记，剥胶，放入已装有染色液的培养皿中，染色0.5-1h。染色完毕后，