发布时间 : 星期二 文章山中申弥的iPS研究历程更新完毕开始阅读
中一个基因就是Fbx15。Shinya的学生Yoshimi Tokuzawa发现Fbx15除了特异表达于胚胎干细胞外，它还能被另外两个胚胎干细胞维持因子Oct3/4和Sox2直接调控。Shinya跟Yoshimi说：Fbx15应该参与维持干细胞多能性和胚胎的发育，我猜你没有办法得到Fbx15敲除的纯合鼠。Yoshimi构建质粒做了基因敲除小鼠，把染色体上的Fbx15基因通过同源重组替换成抗G418药物的基因neo。
复杂的生命又一次愚弄了Shinya：Fbx15敲除的纯合鼠活得很健康，没有显见的表型。Shinya又挑战他的学生说：好吧，Fbx15也许不是小鼠胚胎发育所必需的，但是它应该是维持体外胚胎干细胞所必需的，我打赌你没有办法在胚胎干细胞中彻底敲除这个基因。勤快的Yoshimi于是用较高浓度的G418从干细胞中筛到了纯合的敲除株，还是活得好好的，没有表型[12]。Shinya后来在回忆的时候打趣到：小鼠很happy，细胞也很happy，唯一不happy的就是可怜的学生Yoshimi了。 但是花这么多精力做的敲除小鼠不能就这么算了吧。Shinya又一次开动脑筋，想要废物利用。他发现由于Fbx15只在胚胎干细胞表达，Fbx15 promoter操控的抗药基因neo在成体的成纤维细胞里不表达，所以细胞对药物 G418敏感；而敲除鼠里得到的胚胎干细胞却可以在很高浓度的 G418中生长。如果终末分化的成纤维细胞能诱导成胚胎干细胞，那么它就会产生对 G418的 抗药性。即便成纤维细胞只是获得了部分胚胎干细胞的特性，那么它也应该能抗低浓度的 G418 （图二）。Fbx15敲除鼠实际上提供了很好的筛选诱导干细胞的系统！ 京都大学的化蛹成蝶阶段-iPS
凭借他鉴定胚胎干细胞维持因子的出色工作，2004年Shinya在名气更大的京都大学找到新的职位。除了Fbx15敲除鼠的筛选系统，Shinya还积累了他鉴定的加上文献报道的24个维持因子。Shinya跃跃欲试，他准备破壳而出，拍翅成蝶了！
Shinya的另一位学生Kazutoshi Takahashi此前已经发表了一篇关于干细胞致癌性的Nature文章。Shinya决意让他来承担最大胆的课题-逆分化成体细胞，因为他知道，有一篇Nature文章保底，即便接下来的几年一无所获，他的学生也能承受得了。
图二：筛选iPS的系统。在Fbx15敲除鼠基因组，Fbx15 基因被?geo基因（β-galactosidase 和 neo的融合基因）取代。成鼠角形的成纤维细胞中，内源的Fbx15 promoter关闭，?geo不能表达，细胞在G418药物处理下会死亡；在圆形的多能干细胞中，Fbx15 promoter会启动?geo，细胞能在G418中生长。如果成纤维细胞感染携带干细胞维持因子的逆转录病毒，并能够被逆分化成干细胞，那么它就能逃过G418的选择压力，增殖形成细胞克隆[13]。
即便有很好的筛选系统，这个课题在当初看来也是非常冒险甚至是不可行的。当时的人们普遍认为成体细胞失去了多能性，也许成体细胞本身就是不可逆转的，你做什么也没有用。即便通过转核技术实现了成体细胞核命运的逆转，那也只是细胞核，不是整个细胞。胚胎细胞和成体细胞的染色体是一样的，细胞核具有全能性，尚可理解。而且要实现细胞核的逆转还需要转到卵细胞，让卵细胞质帮助它重编程，而卵细胞质中的蛋白不计其数。如果要实现整个细胞命运的逆转需要让细胞质中所有的蛋白重新洗牌。即便细胞可以重新编程，那也应该是很多蛋白共同参与的。Shinya当年在手上的仅仅是24个因子。也许有另外几百几千种因子被遗漏，缺少其中一种都无法实现重编程。用这24个因子异想天开要实现细胞重编程，根据已有的知识从逻辑上讲可能性几乎为零。 Kazutoshi这个愣头青不管这些，他给成纤维细胞一一感染过表达这些因子的病毒，结果当然没有筛选到任何抗 G418的细胞。Shinya知道如何保持学生的斗志，他故作镇定地说：你看，这说明我们的筛选系统很好啊，没有出现任何假阳性。
在试了一遍无果后，Kazutoshi大胆提出想把24个病毒混合起来同时感染细胞。Shinya觉得这是很愚蠢的想法：没人这么干过啊同学，不过死马当作活马医，你不嫌累的话就去试吧。
等了几天，奇迹竟然发生了。培养板上稀稀疏疏地竟然出现了十几个抗 G418的细胞克隆！一个划时代的发现诞生了。
关键实验取得突破以后，其后的事情就按部就班了。Kazutoshi每次去掉一个病毒，把剩下的23个病毒混合感染成体细胞，看能长多少克隆，以此来鉴别出哪一些因子是诱导干细胞所必需的。最后他鉴定出了四个明星因子：Oct3/4, Sox2, c-Myc,和 Klf4。这四个因子在成纤维细胞中过表达，就足以把它逆转为多能干细胞！
那抗 G418的细胞克隆就一定是多能干细胞吗？他们通过一系列的指标，比如基因表达谱，分化潜能等，发现这些细胞在相当大的程度上与胚胎干细胞相似。
2006年Shinya报道了小鼠诱导干细胞，引起科学界轰动[13]；2007年，他在人的细胞中同样实现了细胞命运的逆转，科学界沸腾了[14]。 展望
回过头来，种种不可能，Shinya怎么就幸运地成功了呢？现在通过更多的研究，我们知道，干细胞特性的维持是由一个基因网络来共同作用的，通过上调某些关键基因就可以重建这个网络，逆转细胞的命运；山中伸弥最后鉴定的四个因子也不是必须的，用24个因子以外的其它因子进行组合可以达到同样的目的。这好比是一张大网，你只要能撑起其中的几个支点，就可以把整张网撑起来。
iPS的发现有着不同寻常的意义。首先，它更新了人们的观念，从此之后人们不再认为细胞的命运不可逆转，不单可以逆转，细胞其实还可以实现不同组织间的转分化（Transdifferentiation）。其次，iPS细胞绕过了胚胎干细胞的伦理困境，很多实验室都可以重复这个简单的实验得到iPS，开展多能干细胞的研究。其三，iPS细胞具有很多胚胎干细胞所没有的优势：来自于病人自身的iPS细胞体外操作后重新植入病人体内，免疫反应将大大减少；如果将病人的体细胞逆转为ips细胞，在体外分化观察在这个过程中出现的问题，就可以实现在培养皿里某种程度上模拟疾病的发生；疾病特异的iPS在体外扩增和分化以后，还可以用于筛选治疗该疾病的药物，或者对药物的毒性进行检测（图三）。
图三：iPS细胞的潜在用途。采自病人的少量成体细胞被逆分化成iPS细胞后，能够在体外增殖，改造，分化成组织特异性的功能细胞。这些功能细胞重新植入人体可以帮助/取代受损的或者得病的器官/组织。iPS或者这些功能细胞也可以作为疾病模型用于一些药物的筛选和毒性测试（图片来自诺贝尔奖网站）。
但是这仅仅是新的开始，生命科学如此复杂和不可预测，要把这些愿景变成现实，让iPS真正造福人类，这其中还有重重的困难。
Shinya Yamanka，这位科学的宠儿，怀着最初帮助更多病人的理想，无畏地踏上了新的征程。
注明：
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作者本人并非研究iPS，所以出现一些错误在所难免，欢迎指正。 本文主要参考了Shinya Yamanaka在NIH的讲座：
https://videocast.nih.gov/Summary.asp?File=15547 物尽其用，欢迎转载。
参考文献
1. Yamanaka, S., Miura, K., Yukimura, T., Okumura, M., and Yamamoto, K. (1992). Putative mechanism of hypotensive action of platelet-activating factor in dogs. Circ Res 70, 893-901. 2. Yamanaka, S., Miura, K., Yukimura, T., and Yamamoto, K. (1993). 11-Dehydro thromboxane B2: a reliable parameter of thromboxane A2 production in dogs. Prostaglandins 45, 221-228. 3. Yamanaka, S., Balestra, M.E., Ferrell, L.D., Fan, J., Arnold, K.S., Taylor, S., Taylor, J.M., and Innerarity, T.L. (1995). Apolipoprotein B mRNA-editing protein induces
hepatocellular carcinoma and dysplasia in transgenic animals. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 8483-8487.
4. Yamanaka, S., Poksay, K.S., Arnold, K.S., and Innerarity, T.L. (1997). A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme. Genes Dev 11, 321-333. 5. Yamanaka, S., Zhang, X.Y., Maeda, M., Miura, K., Wang, S., Farese, R.V., Jr., Iwao, H., and Innerarity, T.L. (2000).
Essential role of NAT1/p97/DAP5 in embryonic differentiation and the retinoic acid pathway. Embo J 19, 5533-5541. 6. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147.
7. Gurdon, J.B. (1962). The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J
Embryol Exp Morphol 10, 622-640. 8. Gurdon, J.B., and Uehlinger, V. (1966). \intestine nuclei. Nature 210, 1240-1241.
9. Laskey, R.A., and Gurdon, J.B. (1970). Genetic content of adult somatic cells tested by nuclear transplantation from cultured cells. Nature 228, 1332-1334.
10. Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J., and Campbell, K.H. (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-813.
11. Tada, M., Takahama, Y., Abe, K., Nakatsuji, N., and Tada, T. (2001). Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr Biol 11, 1553-1558.
12. Tokuzawa, Y., Kaiho, E., Maruyama, M., Takahashi, K., Mitsui, K., Maeda, M., Niwa, H., and Yamanaka, S. (2003). Fbx15 is a novel target of Oct3/4 but is dispensable for embryonic stem cell self-renewal and mouse development. Mol Cell Biol 23, 2699-2708.
13. Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676.
14. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M.,
Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872. 15. Yamanaka S. (2009). Ekiden to iPS Cells. Nat Med 15, 1145-8