发布时间 : 星期四 文章拟南芥Ferrodoxin基因与甜菜曲顶病毒(BCTV)作用机制研究 - 图文更新完毕开始阅读
姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲项病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究在酿酒酵母中研究蛋白质问相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。上个世纪九十年代初期发展成为一种灵敏的真核细胞内鉴定基因的方法，可有效地用来分离能与一种己知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因（王关林等，２００２）。此技术以其简便、灵敏、高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点得到广泛应用（张迪等，２０００）。酵母双杂交系统也可应用于确定两个已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。此外还应用于绘制蛋白质联系图谱，药物设计等许多方面（ＦｉｅｌｄｓＳ．，ｅｔａｌ，１９９４）。酵母双杂交系统是利用真核生物（酿酒酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ＃ｅｖｄｓｉａｅ）的转录调控蛋白ＧＡＬ４的特性建立的。ＧＡＬ４蛋白是编码半乳糖代谢酶的基因的转录激活子。ＧＡＬ４蛋白由两个相互独立的功能性结构域构成，分别是Ｎ一端的ＤＮＡ结合结构域（ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，简称为ＢＤ）和ｃ一端的转录激活结构域（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，简称为ＡＤ）。Ｆｉｅｌｄｓ和Ｓｏｎｇ以与ＳＵＣ２基因调控有关的两个已知有相互作用的蛋白质ＳＮＦＩ和ＳＮＦ４为模型，将前者与Ｇａｌ４的ＢＤ结构域融合，另外一个与Ｇａｌ４的ＡＤ结构域的酸性区域融合。由ＢＤ和ＡＤ形成的融合蛋白现在一般分别称ｏｒ之为“诱饵”（ｂａｉｔ）和“猎物”或靶蛋白（ｐｒｅｙｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ）。如果在ＳＮＦｌ和ＳＮＦ４之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的ＢＤ和ＡＤ就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报告基因（ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ）。通过对报告基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。采用编码１３一半乳糖苷酶的ＬａｃＺ作为报告基因，并且在该基因的上游调控区引入受Ｇａｌ４蛋白调控的ＧＡＬｌ序列。这个改造过的ＬａｃＺ基因被整合到酵母染色体ＵＲＡ３位上。而酵母的６ＡＬ４基因和６ＡＬ８０基因（ＣａｌＳＯ是Ｇａｌ４的负调控因子）被缺失，从而排除了细胞内源调控因子的影响。因为已经知道在ＳＮＦｌ和ＳＮＦ４之间存在相互作用，结果发现只有同时转化了ＳＮＦＩ和ＳＮＦ４融合表达载体的酵母细胞才有１３一半乳糖苷酶活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出口一半乳糖苷酶活性（ＦｉｅｌｄｓＳ．，ｅｔａｌ，１９９４）。目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Ｆｉｅｌｄｓ等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报告基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些４姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究改进。因。其中一个重要改进是引入额外的报告基因，如广泛采用的ＨＩＳ３和厶ｃｚ基这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点，因此可以被相同的转录激活因子（如上述的Ｇａｌ４蛋白）激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象（杨齐衡等，ｄｏｍａｉｎ基因有：１９９９）。目前研究中常用ｂｉｎｄｉｎｇ—刷三４（卜１４７）：ＬｅｘＡ（Ｅｃｏｌｉ转录抑制因子）的ＤＮＡ—ｂｄ编码序列。常用的ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ－ｄｏｍａｉｎ基因有：ＧＡＬ４（７６８—８８１）和疱疹病毒ＶＰｌ６的编码序列等（ＳａｄｏｗｓｋｉＩ．，ｅｔａｌ．１９８８）。用酵母双杂交体系研究植物主要集中于模式植物拟南芥，也偶有用于研究烟草、矮牵牛和菠菜的报道。随着双杂交系统的完善，人们开始用此技术筛选克隆与光敏色素相互作用的蛋白质。美国Ｑｕａｉｌ实验室的Ｎｉ等（１９９９）首先以光敏色素Ｃ末端序列为诱饵，从拟南芥的ｅＤＮＡ文库中筛选到一个与光敏色素发生相互作用的蛋白ＰＩＦ３，是一个转录因子。马力耕和孙大业（２００１）也克隆到一种体内与光敏色素相互作用的转录因子，并证实被光活化的光敏色素可直接进入细胞核与转录因子结合启动基因表达。Ｆａｎｋｈａｕｓｅｒ等（１９９９）和Ｃｈｏｉ等（１９９９）用同样的方法，分别检测到另外两种与光敏色素相互作用的蛋白：ＰＳＫｌ和ＮＤＰＫ２。１．１．４基因干扰技术（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）研究进展１９９０年，ＲｉｃｈＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等人对矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａｓ）进行了研究，尝试加深花朵的颜色。他们将一个能产生色素（ｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）的基因前加上一个强的启动子后，转入矮牵牛中，结果没有看到期待的深紫色花朵，多数花朵成了花斑色甚至白色。因为导入的基因和其内源基因同时都被抑制，所以Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ将这种现象命名为协同抑制“ｃｏ—ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ”。开始认为这种现象是矮牵牛特有，后来发现在其他许多植物，甚至在真菌中也有类似情况。ＲＮＡ酶ＩＩＩ是一种能切割双链ＲＮＡ的酶，参与ＲＮＡｉ反应的Ｄｉｃｅｒ酶是ＲＮＡ酶ＩＩＩ家族的一个成员。Ｄｉｃｅｒ酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个ＲＮＡ酶ＩＩＩ结构域，一个双链ＲＮＡ结合位点。在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下，双链ＲＮＡ被裂解成２ｌ到２３个核苷酸的片断，５姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究称为ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ的ＲＮＡｉ反应。ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ）（ＢｅｒｎｓｔｅｉｎＥ．ｅｔａ１．２００１），它启动了细胞内双链ＲＮＡ进入细胞后，一方面在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下被裂解成ｓｉＲＮＡ，另一方面在ＲｄＲＰ的作用下自身扩增后，再被Ｄｉｃｅｒ酶裂解成ｓｉＲＮＡ。ＳｉＲＮＡ的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２是目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．ｅｔａ１．２００１）。此复合物同与ｓｉＲＮＡ互补的ｍＲＮＡ结合，一方面使ｍＲＮＡ被ＲＮＡ酶裂解，另一方面以ＳｉＲＮＡ作为引物，以ｍＲＮＡ为模板，在ＲｄＲＰ作用下合成出ｍＲＮＡ的互补链（ＳｉｊｅｎＴ．ｅｔａ１．２００ｌ；ＬｉｐａｒｄｉＣ．ｅｔａ１．２００１）。结果ｍＲＮＡ也变成了双链ＲＮＡ，它在Ｄｉｃｅｒ酶的作用下也被裂解成ｓｉＲＮＡ。这些新生成的ｓｉＲＮＡ也具有诱发ＲＮＡｉ的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的ｓｉＲＮＡ大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从２ｌ到２３个核苷酸的ｓｉＲＮＡ到几百个核苷酸的双链ＲＮＡ都能诱发ＲＮＡｉ，但长的双链ＲＮＡ阻断基因表达的效果明显强于短的双链ＲＮＡ。在小鼠的胚胎细胞中也存在ＲＮＡｉ，将７２７个碱基对的双链ＲＮＡ转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的ＲＮＡｉ机制，并抑制了报告基因的表达（Ｂｉｌｌｙ２００１）。Ｅ．ｅｔａ１．根据一条ｍＲＮＡ的不同靶位点可以合成出许多条双链ＲＮＡ，研究发现这些双链ＲＮＡ的作用差别很大（ＨｏｌｅｎＴ．ｅｔａ１．２００２）。ＧＣ含量低的区域似乎双链ＲＮＡ的效果好。线虫内的ｓｉＲＮＡ可以作为引物，以靶ｍＲＮＡ为模板，在ＲＤＲＰ及Ｄｉｃｅｒ的作用下，大量扩增ｓｉＲＮＡ。将ｓｉＲＮＡ的３’末端标记上ＦＩＴＣ使它丧失引物的作用，在将其转入哺乳动物细胞内，它抑制靶基因的作用并没有受到影响。因而研究者推测，哺乳动物细胞内不存在象线虫那样的依赖于ＲＤＲＰ的ＲＮＡｉ放大机制。在哺乳动物细胞中瞬时转染ｄｓＲＮＡ后，ｄｓＲＮＡ的作用只维持了三天。而将表达ｄｓＲＮＡ的载体转入哺乳动物细胞后筛选出的稳定表达株中，在转染八周后ｄｓＲＮＡ仍能有效的抑制靶基因的表达（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ．Ｔ．Ｒ．ｅｔａ１．２００２）。利用载体表达山的ｄｓＲＮＡ为发夹结构，其环状部位的核苷酸的序列和数目对ｄｓＲＮＡ的作用都有影响，研究者发现９个核苷酸比５个或７个核苷酸的效果好。ｄｓＲＮＡ的作用很强，在ｌｎＭ时就能有效的阻断靶基因的表达。ＲＮＡｉ还具有很高的特异性。１９个核苷６姜威中山大学硕士论文拟南芥Ｆｅｒｒｏｄｏｘｉｎ基因与甜菜曲顶病毒（ＢＣＴＶ）作用机制的研究酸的ｄｓＲＮＡ几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了（ＳｕｉＧＨ．ｅｔａ１．２００２），这对ｄｓＲＮＡ的应用是非常重要的，这可以避免ｄｓＲＮＡ降解与靶ｍＲＮＡ同家族的其他的ｍＲＮＡ。双链ＲＮＡ只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达。而具有发卡结构的双链ＲＮＡ能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，Ｃ２Ｃ１２细胞中，用长链具有发卡结构的双链ＲＮＡ有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链ＲＮＡ的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了（ＰａｄｄｉｓｏｎＰＪ．Ｅｔａ１．２００２）。７