发布时间 : 星期一 文章工业微生物基本类型及其基础知识更新完毕开始阅读
目前，次级代谢产物的生产都还是沿用分批发酵方法，抗生素类的产物在此条件下又多为在菌体生长速率下降后才积累，但又难以长期持续合成。因此，通过控制培养条件以尽量
维持次级代谢产物的合成期，亦是获得过量生产的重要途径。常用的提高次级代谢产物产量的方法有以下几种： 1，补加前体类似物
在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。如青霉素G的生产中，苯乙酰—CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。青霉素分子是6-APA环形成后，再形成不同侧链。加入不同的前体就可以得到不同种类的青霉索，补加苯氧乙酸即得到青霉素V。多肽类和放线菌素类抗生索的合成中，也都能通过加入不同前体而得到不同种类的抗生素。这也可以称之为定向合成 。
加入硝酸盐可提高利福霉索的产量，其原因在于它抑制了脂肪酸的合成，使合成脂肪的前体丙二酰-CoA转为利福霉素分子的脂肪环提供前体。
次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这部是在生产应用中需综合考虑的。 2，加入诱导物
把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量，如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。
3，防止碳分解代谢阻退或抑制的发生
青霉索发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，早已是一项很有效的提高产量的方法。
使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解阻遏的发生。
加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。
4，防止氮代谢阻遏的发生
避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生索发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。
使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。
为防止碳、氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 5，筛选耐前体或前体类似物的突变抹
加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体育抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产；如抗苯乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。
半胱氨酸、缬氨酸是 内酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的类似物，三氟亮氨酸、DL-缬氨酸的抗性菌株，其β-内酰胺类抗生索产量会提高。 6，选育抗抗生素突变株
链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生索产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生索的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果已有不少报道。 7，筛选营养缺陷型的回复突变株
次级代谢产物都来自初级代谢产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低，但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不清楚，估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中，运用此方法曾获得高产菌株。
8，抗毒性突变株的选育
重金属离子、羟胺类物质对 -内酰胺类抗生素产生菌有毒，但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗生素类物质过量产生的突变株。曾由头孢霉素C对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。
以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。但是，微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的，研究得比较清楚的只是少数。因此，上述方法的应用往往也是经验性的。 在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。
三、高浓度微生物的培养
1，为什么要采用高浓度微生物的培养？
微生物液体发酵大都采用分批培养，这种培养方式的缺点是：发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大大提高发酵设备
的利用率，降低生产成本。基于这种目的，人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。例如用高细胞浓度连续培养技术，培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2)，可得到95g／L的菌体。用同样的方法培养酒精酵母可得到219g／L的菌体。而一般用分批法培养酵母和细菌，得到的菌体浓度仅为10g／L左右。
2，高细胞浓度培养技术的原理：
采用一定的工艺技术，保证微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。
3，高细胞浓度培养技术的优点 （1）可大大提高发酵设备的利用率
（2）节省能源 4，高浓度细胞培养的方法 （1）流加培养
要保持微生物生长的适宜环境条件以达到高菌体浓度，就必须采用恰当的流加补料方式，补充生长所需的所有营养物。
因渗透压的影响，在分批式培养中，不能靠过高地提高培养基浓度来获取高浓度的细胞采用流加技术，可不断地满足菌体生长繁殖的需要，最终可以获得高浓度的细胞。采用流加培养技术，还可以实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等。这类技术还有一大优点是，无需增添设备，只需改进工艺就可以在生产上广泛应用。流加培养技术还可解决以下问题：
底物抑制：在许多发酵过程中，某些底物如乙醇和苯环类化合物，只有在低浓度情况下，才不抑制菌体的生长。在分批培养中，若提高这些底物的浓度，就会出现底物对生长的抑制。而在发酵过程中流加这类底物，控制它们在发酵液中的浓度，使之一方面能不断满足菌体生长的需要，另一方面又不会抑制菌体的生长，这样，底物抑制就能被消除。
分解代谢阻遏：如果微生物利用葡萄糖等易于代谢的碳源，代谢产生的物质会使细胞内的环腺苷酸浓度降低，造成某些酶终止合成，这种现象称分解代谢阻遏。在流加培养过程中，缓慢流加这种碳源，可消除分解代谢阻遏作用。
葡萄糖效应：培养面包酵母时，存在一临界葡萄糖浓度，培养基中葡萄糖高于此浓度时，会部分代谢成乙醇，甚至在有充足溶解氧的条件下也会产生乙酵，此现象称葡萄糖效应。采用流加技术，可以控制葡萄糖浓度在此临界浓度以下，这样就可以防止乙醇产生，得到高浓度的面包酵母。
为了实现需氧微生物的高浓度培养，需要一个能供给大量氧气的高性能发酵罐。溶解氧浓度[DO]需要保持在每升几个微克以上，但也不能过高。大体上应该保持在10-9g／L以下。不过，需氧微生物培养中，最容易缺乏的营养物仍然是[DO]。完全可以说[DO]是高菌体浓度培养生长速率的控制因素。
碳源是最重要的营养物，要用恰当的方式自动流加。氮源可结合pH控制与
碳源一起流加，并利用氨气传感器或铵离子选择电极等实行自动流加控制。微生物生长至少需要十几种无机离子，很难对这么多离子的浓度进行连续检测，因而无法对其浓度进行反馈控制，可以与碳源或氮源同时自动流加。加料流量根据物料衡算确定，所有营养物都可通过计算机控制自动流加。流加培养的控制方式无反馈控制
? 恒速流加 ? 变速流加 ? 指数流加
反馈控制
? DO-恒定控制pH-恒定控制CO2生成速率控制细胞浓度控制底物浓度控
制
（2）高细胞浓度连续培养
原理：无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心。膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。
除去抑制物质的方法：透析培养：通过半透膜使培养液与培养基接触，培养液中的细胞不能透过半透膜，只有反应产物透过膜进入培养基溶液。在透析培养中，透析装置有两个作用。一是将生长抑制性物质透过膜排出培养罐，从而减少或排除抑制作用。二是使培养基贮罐中的营养物透过膜进入微生物培养罐，以补充其消耗。
萃取发酵：就是向发酵罐内加入难溶于水的有机溶剂，选择性地萃取抑制生长的物质，从而减轻有毒产物对发酵速率的抑制作用。这种操作方式的主要目的是获得尽量多的代谢产物，同时可减轻有毒产物对微生物生长的抑制作用，从而提高菌体浓度。这时需要选择分配系数大、对微生物毒性小的廉价溶剂。有人用这种方法对丙酮及丁醇发酵进行了研究。
过滤培养：是利用一种只能使培养液通过而不能使微生物通过的微滤膜边过滤边培养的方法。过滤的同时还必须同时流加物料。作为微滤膜可采用能够灭菌的精密陶瓷或合成高分子材料。培养液高速流过膜表面，滤液沿着与过滤膜垂直的方向通过膜流出，因此称为错流过滤。有人将这种培养方式用于乳酸菌和二裂殖茵培养的研究中。
菌体循环利用 这种方法大致过程是：待分批发酵终了将菌体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发酵时间可大大缩短。第二批发酵终了，进行同样处理，然后再开始第三批发酵；这种技术与前面所述两种技术原理不同，但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。 （3）高细胞浓度培养中的问题 A，培养基流加控制与其他条件控制
培养基的流加控制分反馈控制与无反馈控制两类。反馈控制依据反馈控制参数如溶解氧、pH、呼吸商等数据变化，通过改变流加速度从外部控制。无反馈控制是根据微生物的代谢特征及生产要求制定流加曲线，井按曲线进行流加。由于高浓度细胞的积累，pH、溶解氧等都需要进行调节以满足菌体生长与产物合成的最优条件。
B，菌体分离装置的效能
在高细胞浓度连续培养中，采用的各种细胞分离设备存在一些问题。例如，用膜分离菌体时，菌体在膜表面沉积会造成膜过滤效率降低；用离心机分离菌体容易造成污染；这些问题都需要新工艺新材料来解决。
C，菌种退化
对基因工程菌来说，这一问题尤为重要。因为工程菌中的重组质粒往往不稳定，容易在传代中丢失，丢失掉重组质粒的工程菌不产生目的产物。因此，用高细胞浓度培养法培养工程菌时，还要考虑能保持质粒稳定的工艺条件。