发布时间 : 星期二 文章靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构建 - 毕业设计论文-精品 - 图文更新完毕开始阅读
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1.1.6 RNAi在抗肿瘤方面的研究
目前对肿瘤的治疗手段主要有药物化学治疗、手术切除和放射治疗，这些治疗方法均无法做到特异性地杀伤及完全根除肿瘤，而且副作用较大。RNAi 具有特异性、简易性及高效性的特点，可稳定沉默突变基因，而对正常基因的表达不产生影响，在肿瘤的研究及治疗上有着无法比拟的优势。随着 RNAi 技术的不断成熟，肿瘤的研究有了空前突破，研究的重点主要在有关肿瘤免疫逃逸、肿瘤性疾病信号传导的途径、癌基因及抑癌基因的敲除、提高肿瘤对化疗及放疗的敏感性等方面[18]。
1.2 用于RNAi的载体
基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。是指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体具有以下的功能：
（1）运送外源基因高效转入受体细胞； （2）为外源基因提供复制能力或整合能力； （3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
目前使用的已知载体除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色体载体以及动、植物病毒载体等[19]
作为基因工程中使用的载体必须具备以下条件：
（1）有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；
（2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； （3）具有筛选转化子的选择性标记基因； （4）分子量小，拷贝数多；
（5）具有较高的外源DNA的载装能力；
（6）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。
载体按其应用范围，可以分为克隆载体和表达载体。克隆载体是指用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体是指使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。
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1.2.1载体的选择
质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。构建的质粒载体与天然质粒相比通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)，同时可能带有多个人工合成的单一限制性内切酶识别位点。但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。[20]除此之外，质粒载体一般还带有一些可以进行体外转录外源DNA、鉴定片段的插入方向等用途的序列。[21]
细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链DNA分子，只有酵母的杀伤质粒已知是RNA分子。环状双链DNA分子有三种构型。包括两条链的环状结构都保持完整的呈超螺旋构型的共价闭合环状DNA(cccDNA)，双链中有一条链环状结构完整，只在另一条单链上有切口的开环DNA（ocDNA)以及双链断裂呈线状的线状DNA[22]。在琼脂糖凝胶电泳时，同种质粒的三种构型迁移速率各不相同，超螺旋构型的共价闭合环状DNA走得最快，其次是线状DNA，最慢的是开环DNA。
1.2.2 质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：
（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组
（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
1.3 MRP1的研究进展
在1992年多药耐药相关蛋白1（MRP1又被称为ABCC1）的识别以及它的起始特征阐明了这种蛋白确实代表了一种选择性药物泵。编码MRP1的cDNA第一次克隆是通过从阿霉素-选择性的多药耐药人肿瘤细胞系（H69R）中筛选差异cDNA得到的1。MRP1
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基因(ABCC1)位于染色体16p13.1上并且编码含有1531个氨基酸的蛋白。经序列分析，将MRP1分为ATP-结合框超家族中的一员，MDR/P-糖蛋白也属于这一超家族。MRP1是一个膜整合糖磷蛋白，其表观分子量为190kDa[23,24]，一个运用ATP结合/水解[25,26]产生的能量，来行使此蛋白主要的有活性的转运功能。
1.3.1 MRP的转运底物、组织分布及生理作用
MRP1的底物 直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。典型的结合型底物包括：谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，
MRP1的组织分布 MRP1在体内的表达可以说是无所不在。MRP1表达水平最高的组织包括：肺，睾丸，肾，心和胎盘；
MRP1的生理作用 MRP1在作为机体主要防线的组织中分布，以及MRP1的底物特异性，表明MRP1有保护机体免受外源生物质和内源毒性代谢物侵害的生理作用。通过对基因敲除的动物进行研究确定了MRP1的功能。尽管很多体外实验明确的证实了：MRP1介导外源和内源物质的转运。但是几次尝试证实MRP1在体内的保护作用都没有成功。
1.3.2 MRP在组织中的表达
典型的MDR机制在肿瘤耐药中起一定作用，但多数学者发现MDR1基因和P-gP在肿瘤中的表达水平并不高，难以解释NSCIC的高度耐药。Narasaki等发现许多癌组织同时表达MRP1和MDR1，但后者表达较低，故认为MRP 1较MDR1能是反映肿瘤多药耐药更好的指标。在肿瘤复杂的耐药机制中，MRP1和MRP3的过度表达发挥了重要作用。Oguri等报道在运用铂类化疗药物后，40例肿瘤患者的MRP5表达较用药前明显增高，且伴有MRP1及GSH的升高，故认为MRP5可能与GSH 一起参与MRP1导的多药耐药[27]。
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1.4 基因治疗
基因治疗是肿瘤多药耐药逆转的手段之一，所谓基因治疗是指利用遗传或分子生物学方法将外源基因导人生物体内或人体细胞内，以弥补所缺失的基因或关闭、降低异常基因的表达，从而对疾病进行治疗。基因治疗是治疗肿瘤的新手段，目前共有3种MDR基因治疗的策略：将相关凋亡基因转导入肿瘤细胞，促使其凋亡；使用反义技术抑制肿瘤细胞耐药基因表达；将外源mdr1基因转导入人造血干细胞以提高骨髓对化疗药物的耐药性。
1.5 本课题在国内外的研究现状
多药耐药蛋白基因1编码的多药耐药蛋白的过度表达是重要的肿瘤耐药机制之一。RNAi是一种用dsRNA作为序列特异性的触发器指导同源单链RNA降解的细胞机制。在最近的研究中显示特定目的基因的表达可被RNA干扰高效抑制。小干扰RNA(siRNA)作为一种中间介质，介导哺乳动物细胞中与之同源基因的沉默
[28]
。RNAi的作为一种经济、快捷、高效的技术手段，正逐步被应用于遗传性疾病、从1990年，植物学家对矮牵牛花注入红色素基因，却使花变成白色，到1995年
病毒性疾病以及肿瘤等的基因治疗。
Su Guo博士利用线虫完成的实验，科学家首次发现了RNA干扰的现象，但是并未能对其理论做出合理解释。直到1998年，Andrew Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，Andrew Fire和Craig Mello将这一现象命名为RNAi，并于1998年在Nature上发表了相关论文。随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于果蝇，线虫，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNA干扰来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。近几年来RNAi的研究取得了很大进展,2001年它被《Science》杂志评为十大科学成就之一,2002年被评为十大科学成就之首。[29]自2002年5月以后，先后出现将RNAi技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美国科学家Mc Caffrey）和癌细胞（如我国徐根兴教授）的研究报道。这一发现提示可以应用RNAi技术来抑制MRP1基因的蛋白表达。Nieth C等（2003）发现临床上化学合成siRNA更适于联合治疗，可以利用化学合成的siRNA同时转录多种MRP相关基因，如其他ABC转运编码基因或细胞凋亡编码基因等，而且也可同时编码其他致癌基因或血管生成因子进行联合治疗2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家，以表彰他们发现了RNA干扰现象。
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