发布时间 : 星期二 文章分子生物学研究法-基因功能研究技术 - 图文更新完毕开始阅读
（图6-25）。实验表明，棉花乙烯合成酶基因ACS2与钙离子依赖性蛋白激酶CDPK1之间存在相互作用，而该蛋白与CDPK32及CRK5没有发生相互作用。ACO1与这三个蛋白都没有发生相互作用（图6-26）。
3、GST及GAD融合蛋白沉降技术
该技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白（图6-27）。GST沉降试验通常有两种应用：确定探针蛋白与未知蛋白间的相互作用，确证探针蛋白与某个已知蛋白之间的相互作用。与此相类似，实验中把GAD与PIF3的不同区段相连接成为钓饵，研究该重组蛋白在体外与光敏素B (phyB)、其缺失N-37位氨基酸的突变体或光敏素A (phyA) 的相互作用情况。研究发现，光敏素B (phy B)能与PIF3发生强烈的相互作用（超过30％的光敏素B能被PIF3沉淀下来），但缺失N-37位氨基酸的phy B突变体以及光敏素A (phy A)只能与PIF3发生较弱的相互作用，约5％的光敏素A，或约10％的N-37位氨基酸缺失突变光敏素B能被沉淀下来（图6-28）。
4、细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET）
FRET现象是21世纪初叶发现的。FRET荧光能量给体与受体之间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程又称为长距离能量转移，有三个基本条件：
（1）给体与受体在合适的距离（1～10 nm）；
（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；
（3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。
FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有部分重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。常用的探针有三种：荧光蛋白，传统有机染料和镧系染料。
荧光蛋白是一类能发射荧光的天然蛋白或突变体，常见的有绿色荧光蛋白
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（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。
传统有机染料是指一些具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。常见的有荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等，该类染料分子体积较小，种类较多且大部分为商品化的分子探针染料，因此被广泛应用。
镧系染料一般与有机染料联合使用，分别作为FRET的给体或受体，检测的准确性和信噪比较之传统染料有提高。
研究蛋白质间相互作用时，FRET一般与荧光成像技术联用，将蛋白标记上荧光探针，当蛋白间不发生相互作用时，其相对距离较大，无FRET现象，而蛋白发生相互作用时，其相对距离缩小，有FRET现象发生（图6-29），可根据成像照片的色彩变化直观地记录该过程。
6. 3. 4 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immuno Precipitation，ChIP）
是一项新发展的研究活体细胞内染色质DNA与蛋白质相互作用的技术，其主要实验流程是：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应,沉淀该复合体，从而富集与目的蛋白相结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化及PCR检测（图6-30），获得该蛋白质与DNA相互作用的信息，包括具体的DNA序列特征，位置，结合时间、亲和程度以及对基因表达的影响等（图6-31）。
ChIP技术不仅可以用来检测体内转录调控因子与DNA的动态作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系，定性或定量检测体内转录因子与DNA的动态作用。如果能将你所研究的目的蛋白定位到染色质DNA上某个或某些功能基因的启动子区或附近，对于确定你所感兴趣的蛋白质的生物学功能可能会是一次质的飞跃。
6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技术及其应用
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。研究发现，对线虫注射外源双链RNA
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（double-stranded RNA）可诱发与该RNA高度同源的基因序列的特异性“沉默”。现在已经知道，RNAi是一个多步骤反应过程，包括对触发物的加工、与目标mRNA的结合以及目标mRNA的降解。至今已在果蝇、锥虫、涡虫、线虫等许多动物及大部分植物中陆续发现了RNAi效应。
双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的外源双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标mRNA。因此，siRNA是导致基因沉默和序列特异性RNA降解的重要中间媒介。较短的双链RNA不能被有效地加工为siRNA，因而不能介导RNAi。siRNA具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。由siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能（图6-32）。siRNA还可作为特殊引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。因此，即使外源siRNA的注入量较低，该信号也可能迅速被放大，导致全面的基因沉默。
在哺乳动物细胞内，较长的dsRNA会导致非特异性基因沉默，只有大约21-25个核苷酸的siRNA才能有效地引发特异性基因沉默。非哺乳动物细胞可以利用较长的双链RNA直接诱导产生RNAi而无须合成siRNA，因此，设计非哺乳动物细胞RNAi实验的步骤比较简便，只要通过目的基因体外转录得到所需要的dsRNA，再通过浸泡、注射或转染靶细胞即可实现RNAi。
6. 4 基因芯片及数据分析
应用传统的实验方法如RT-PCR或Northern印迹杂交法研究基因的表达调控规律，受电泳泳道数量的限制，每次一般只能研究很少量的靶基因。随着功能基因组学研究的不断深入，迫切需要能同时监测大量靶基因表达的实验手段，以期迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。
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基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术就是在这种情况下应运而生的。
6. 4. 1 基因芯片技术原理
基因芯片是一种小型分析装置，能够快速和精确地研究生物体、组织、器官或细胞内基因组的遗传信息。制作基因芯片时，可用机械臂将大量已知或未知序列的DNA片段点在玻璃片（通常为2×2厘米2）、金属片或尼龙膜上，再经过物理吸附作用使之固定化。也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达情况（图6-33）。荧光标记的cDNA与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，荧光信号的强度和基因表达的丰度成正相关。基因芯片这种微型化装置具有巨大的容量，使科学家能在一个实验中分析整个基因组的变化。用基因芯片进行研究一般包括五个步骤：生物学问题的提出、样品制备、生化反应、检测、数据模型分析。
6. 4. 2 基因芯片的点制过程
1、简易基因芯片
制作简易基因芯片时，使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜上，再经过物理吸附作用（85℃）烘烤或化学处理使DNA分别固定在载体上。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达调控情况（图6-34）。简易芯片上的基因数量少（一般不超过2，000），主要用于研究小部分特定的基因表达状态。简易芯片一般可以用手工制作或者机械手点样。
2、大规模基因芯片
大规模基因芯片通常涉及基因组规模与数量（一般大于10,000个基因），可采用接触式点样、非接触式点样或者半导体技术制备样品。其主要工作流程如下：
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