发布时间 : 星期二 文章微生物检验技术考试要点（整理-中级）更新完毕开始阅读
病原鉴定：生物特性是具有大量高活性的尿素酶，迅速分解尿素，氧化酶＋、触酶＋，具有碱性磷
酸酶、r-谷氨酰转肽酶活性，硝酸盐还原＋，可生长于5%甘氨酸、0.04%氯化三苯四氮唑培养基中，三糖铁中不产生硫化氢，微需氧5～8%，37℃生长，25℃和42℃均不生长的G－菌，初次分离要3～4天。
快速检测：尿素呼吸试验---简单快捷，可以特异地诊断HP现症感染，敏感性高。主要采用13C、14C（放射性同位素）标记尿素，13C用于儿童和孕妇。
90.《伯杰系统细菌学分类》的标准：G染特性，形态，鞭毛，芽胞，荚膜，代谢产物。 91. 有芽胞的厌氧菌：只有梭菌属包括83个种。厌氧菌每克粪中高达1012个，标本绝不能被正常菌污染，应尽量避免接触空气。最理想的标本是组织，送到实验室后20～30min内处理完不超过2h。应接种固体和液体两种培养基，应使用预还原培养基，液体培养基应煮沸10min以驱氧并立即冷却。每份标本至少接种三个血平板，置于有氧，无氧，5%～10%CO2环境中培养。厌氧手套箱培养法是迄今最佳厌氧培养仪器之一。
92. 厌氧状态的指示剂有：美蓝和刃天青，无氧时白色，有氧时美蓝蓝色，刃天青粉红色。紫外线下出现荧光也是厌氧菌参考之一，卡那霉素用于梭杆菌与类杆菌的区分，甲硝唑用于厌氧菌和非厌氧菌的区别。气液相色谱已成为鉴定厌氧菌及其分类比较可靠的方法。
93. 破伤风杆菌：鼓槌状，早期培养G＋，48h后特别是芽胞形成后G－，的O和H抗原，主要症状为骨骼肌痉挛，不发酵糖类，能液化明胶产H2S。产生两种外毒素：破伤风溶血素、破伤风痉挛毒素
94. 产气荚膜梭菌：G＋，20～50℃均能生长，最适为45℃，双层溶血，可分解糖类产酸产气，出现汹涌发酵现象，分5型，主要是A型，外毒素以A毒素为主，本质是卵磷脂酶（α毒素），在蛋黄琼脂平板上菌落周围出现乳白色浑浊圈。所致疾病为气性坏疽，有捻发感，青霉素为首选，万古为次选。
95. 肉毒梭菌：G+，芽胞胶囊于次极端呈汤匙状或网球拍状，严格厌氧，8型，以A，B多见，毒素不耐热，1min煮沸即死。
96. 无芽胞厌氧菌是一大类正常菌群，引起感染是内源性感染。
97. 白喉棒状杆菌：为放线菌，G+，无荚无芽无鞭无毛，奈瑟（Neisser）染色成黄褐色，一端或两端染成蓝色或深蓝色颗粒即异染颗粒，阿培特（Albert）染色菌体呈蓝绿色，异染颗粒成蓝黑色。
分离培养：棉拭子取咽喉部、鼻腔、皮肤病变部位，血平板，吕氏血清斜面（生长迅速，乳白色，S型，形态典型），哥伦比亚血培养基及亚碲酸钾血琼脂（48小时以上，菌落黑色，筛选鉴别）。白喉毒素是一种毒性强、抗原性强的蛋白质，B-棒状杆菌噬菌体毒素基因（tox+）编码的蛋白质，PCR扩增tox+基因辅助诊断不能确诊。免疫沉淀试验（EleK平板试验）检测产生白喉外毒素，是诊断白喉的关键试验。细菌一般不侵入血，但外毒素可入血引起毒血症，不能立即送检时应浸于无菌生理盐水或15%甘油盐水中。出现各种心肌炎，软腭麻痹是白喉晚期死亡的主要原因。（白喉类毒素、百日咳菌苗、破伤
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风类毒素的混合疫苗DPT）
98. 百日咳鲍特菌：专性需氧，常用包-姜培养基（含青霉素G）细小S银灰色不透明珍珠状菌落，在加血培养基上,周围有狨毛状狭窄溶血环，液体培养基中混浊生长。菌落常S-R相变异，Ⅰ相S型，Ⅱ、Ⅲ相过渡型，Ⅳ相R型。有百日咳毒素，丝状血细胞凝聚素和腺嘌呤环化毒素。细菌不进入血流。临床分为3个期：1、卡他期2、痉咳期3、恢复期。依据菌落性状及凝集试验确诊。抗原有PT、FHA，主要用ELISA方法。可获持久免疫力
咳碟法：包-姜培养基（含青霉素G）置10cm使飞沫直射于培养基上，37℃2-3天
鼻咽拭子法：如不能及时接种可放入0.3毫升PH7.2—7.4的1%蛋白胨生理盐水中2小时内检 99. TBE-Tris硼酸缓冲液，长时间电泳选用。MIC-最小抑菌浓度
101．决定细菌的形态因素：培养基的成份、PH、培养时间、温度。直接观察细菌的超微结构：超薄切片技术、电子显微镜。
102. 芽胞：在80℃水中迅速死亡，在100℃水中能耐受2小时以上，在70%乙醇中能存活20年。高压蒸气灭菌杀死细菌牙芽胞最有效。荚膜的重要功能：抗吞噬。是构成细菌毒力的因素之一。
卫生毒理学
1．外源化学物在体内的生物转运：吸收、分布、代谢、排泄四阶段。
化学毒物在体内的代谢分为两相：Ⅰ反应---氧化、还原、水解；Ⅱ反应---与体内源性物质结合 亚慢性毒性试验目的：最大无作用剂量、最大耐受剂量估测阈剂量。（选用两种种属及啮齿类、非啮齿类，初断乳动物）
慢性毒性试验目的：最小有作用剂量、阈剂量、最大未观察到有害作用剂量（选用两种种属及啮齿类、非啮齿类，初断乳动物）
危害性评价组成：认定、描述、接触评定、特征分析
毒理学试验项目：第一阶段：急性毒性试验。第二阶段：遗传毒性试验。第三阶段：亚慢性毒性试验。第四阶段：慢性毒性试验和致癌试验
GB 19489—2004《实验室生物安全通用要求》分级：危害等级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。 生物安全防护水平（BSL-1、2、3、4）。
生物安全柜一级：可保护工作人员和环境。生物安全柜二级：分A1、A2、B1、B2可保护工作人员、环境、样品。生物安全柜三级：
2．普通光学显微镜：最高分辨率0.2um,不能观察细菌的亚结构
3．暗视野显微镜：分辨率0.02-0.04um,载玻片厚度1.0mm、盖玻片0.17 mm 4．荧光显微镜：
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5．滴定管精度为0.2—0.1ml,微量滴定管精度为0.005ml。微量吸管5—1000ul。培养皿分：5、7.5、9、10cm
蛋白质、核酸提取及相关设备
一、蛋白质分离纯化----实验室常用盐析法（硫酸铵）。
核酸纯化----酚、氯仿抽提
制备细胞外膜蛋白----超声波细胞粉碎机。
大多数限制内切酶使用温度37℃，保存温度是-20℃。 二、层析
凝胶过滤法（分子筛层析法）---主要用于蛋白或核酸分离。介质：葡聚糖。过滤中先洗脱的是大分子物质，后小分子物质。原理：纤维素或凝胶介质带电荷不同。 三、检测仪
1、分光光度计及检测物质 检测细菌浓度 测定颜色 检测蛋白 检测核酸 分光光度计 可见分光光度计 可见分光光度计 紫外分光光度计 紫外分光光度计 波长nm 600 450 280 260 比色皿 玻璃 石英 石英 2、紫外透射仪：暗室紫外线下看DNA条带。 3、测序仪：蛋白测序仪---测定氨基酸排列顺序
DNA测序仪---测核苷酸排列顺序。物质是；质粒、噬菌体、PCR产物 4、扩增仪：能做PCR称DNA扩增数 5、酶标仪： 二、电泳类： 用于 原 理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 蛋白质、核酸分离 用垂直电泳槽，凝胶介质形成立体多孔网状结构，过硫酸铵起催化聚合作用, Tris-甘氨酸缓冲液。分离DNA片段最佳范围5-500bp 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 琼脂免疫电泳 蛋白分离和鉴定 蛋白分离 聚丙烯酰胺浓度越大，线性分离范围越小。十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白，常用蛋白染料--考马斯亮蓝，甘氨酸—缓冲 用琼脂糖作介质。为正交的交变脉冲电场；条带靠近负极为大片段DNA，靠近正极为小片段DNA。DNA染色用溴化乙锭（EB）或硝酸银。（分析大分子物质） 琼脂糖凝胶电泳 核酸分离与纯化 1%琼脂糖作支持介质，有“分子筛”和“电泳”的双重作用。用水平电泳槽，充分分离DNA片段最佳范围200bp-50kb
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脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 核酸分离 等电聚焦电泳（IFE） 对流免疫电泳（CIE） 火箭电泳 交叉定量免疫电泳 醋酸纤维膜电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质分离 以两性电解质制造凝胶有不同PH，使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。用聚丙烯酰胺制备等电聚焦电泳凝胶。浓缩效应、分辨率高、重复性好、用时少 测定抗体或抗原 缓冲液是PH8.6巴比妥液，使抗原抗体均带负电，抗原向正泳，抗体电渗作用向负泳。 测抗原量 免疫球蛋白鉴定 单链（DNA或RNA） 片段分离与纯化 四、快速斑点免疫金渗滤法（滴金免疫法）：属于常用的胶体金技术。方法是---以硝酸纤维素膜（NC膜）为载体，将试剂和标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应，全程可于数分钟内完成，阳性在膜上呈红色斑点。基本原理是间接法或夹心法
免疫胶体金技术用于检测：抗原、半抗原、抗体 ATCC是指美国典型培养物保藏中心。
MPS---单核-吞噬细胞系统，又称巨噬细胞系统。
玻片凝集反应---2-3分钟看结果；试管凝集反应---18—24小时看结果；沉淀反应---72小时看结果；补体结合试验（CFT）---30分钟看结果
过滤式微生物采样器根据过滤材料不同有：薄膜过滤器、玻璃纤维过滤器、凝胶过滤器、谷氨酸碱过滤器。
病毒的分子生物学鉴定：病毒核酸和蛋白质测定。蛋白质使用--免疫测定技术、电泳技术、质谱技术；核酸使用—探针技术、杂交技术、聚合酶链反应技术
构建基因组文库，初始DNA长度须在90kb以上。纯化的mRNA在70%的乙醇中可保存1年以上。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4或6个核苷酸。
为获得条带清晰的DNA电流图谱DNA用量为0.5—1.0ug.
在酶切图谱制作过程中,分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法---聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳。
普通水平电泳制备染色体DNA酶切图谱时，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系，分离＜0.5kb DNA片段所需胶浓度是1.2%-1.5%，分离＞10kb DNA片段所需胶浓度是0.3%-0.7%，在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所加电压成正比，电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使＞2kb DNA片段的分辩率达到最大，所加电压不得超过5V/cm。
细菌的培养技术
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