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环境工程微生物学实验技术
分散地分布，便于计数与提高测定的精确度。混匀后水平放置培养皿待凝。
图3-5 混菌摇匀方式和步骤示意图
8）倒置培养
待平板完全凝固后，倒置于37℃恒温箱中培养。 9）计菌落数
培养48h后取出平板，选出菌落数在30~300个/皿范围内的各皿，计算每皿的菌落数，取平均值乘以稀释倍数即得出活菌总数。并详细观察各种菌落形态记录之。计数时，可用彩色或钢笔在皿底点涂菌落法进行计数，以防漏计或重复。在高密度分布的菌落平板中，可如图3-6所示，选计有代表性的1/8~1/4区域后粗略统计菌落数，以判断稀释中的误差情况供参考。
图3-6 平板菌落的全皿与分区计数法示意图 1. 30～300个/皿，全皿计数 2.大于1000/皿，分区计数
10）清洗器皿
将计数后的平板在沸水中煮5~10min后清洗晾干。 三、实验设备与材料
1、菌种 大肠杆菌
2、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
3、器皿 试管，培养皿，移液管（5、10、1ml）。 4、其他 无菌生理盐水，试管架，记号笔和恒温箱等。 四、实验基本要求
1、各稀释度菌液移入无菌培养皿内时，要―对号入座‖，切莫混淆。
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2、不要直接取用来自冰箱的稀释液，以防因冷冻刺激影响活细胞生长繁殖而使菌落形成率受影响。
3、每支移液管只能接触一个稀释度的菌液试管，每支移液管在移取菌液前，都必须在待移菌液中来回吹吸几次，使菌液充分混匀并让移液管内壁达到吸附平衡。
4、菌液加入培养皿后要尽快倒入融化并冷却至50℃左右的琼脂培养基液，立即摇匀，否则菌体细胞常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。 五、实验报告要求
1、结合本教材及实验课所学内容，写出实验报告。
2、实验报告内容包括实验原理、实验目的、实验器材、实验步骤、结果讨论等。
思考题：
1、平板菌落计数的原理是什么？它适用于哪些微生物的计数？
2、稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45~50℃左右才能倾入到培养皿内？
3、菌液样品移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？
3、要获得本实验的成功，哪几步最为关键？为什么？
4、仔细观察你的计数平板，试比较长在平板表面和内层的菌落各有何不同？为什么？
六、相关基础知识
制平板技术
（1）将灭菌培养皿（可5个叠在一起）放在面前，与酒精灯成直线。 （2）右手拿已溶化好的营养琼脂培养基，左手拔下棉塞，在火焰上轻烧瓶口，转动如图3-7。
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图3-7 倒平板
（3）用左手大拇指和食指打开培养皿盖，使成约45℃角，将培养基瓶口伸入，倒入培养基约10-15ml，然后取出培养基瓶，盖好培养皿盖，左手迅速轻轻摇培养基，使其布满整个培养皿底部，放在平坦桌面上，注意此时使三角瓶口位于靠近火焰处以避免污染，如此连续倒好各培养皿，冷却后即成平板。如图3-8。
图3-8 倒平板
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实验四：微生物的纯种分离
一、实验目的
1、学习、掌握酵母菌稀释分离技术。 2、学习从样品中分离、纯化所需菌株。
3、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4、学习平板菌落计数法。 二、实验内容与方案
1、稀释分离法
平板分离菌种有倾注法和涂布法两种。本次实验分离酵母菌采用涂布法。 1）制备菌悬液
称取果园土样1g，加入到一个盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，震荡20min，即成10-2的土样稀释液。
2）涂布法分离
依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45~50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述10-6、10-5、10-4三个稀释度菌悬液0.1ml，依次滴加于相应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒与培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破（图4-1）
图4-1 涂布操作过程示意图
3）培养
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