发布时间 : 星期日 文章Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)更新完毕开始阅读
***Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞***实验准备： 2×HBS(ul)配方：8g NaCl，0.14g Na2HPO4?2H2O或0.2g Na2HPO4?7H2O，6.5g HEPS，调节pH值7.0， 最终溶于500ml双蒸水中,4℃保存。
2MCacl2配方：87.6g Cacl2·6H2O溶于200ml双蒸水中，用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存，不可冻牢凝固。 ^^^Day 1
1、在转染前24小时，在10cm dish中（面积约为78.5cm2）中铺3.6 x106 293T细胞，于9ml DMEM（hyclone高糖）+10?S+PS，待次日细胞汇合度达到70%。
^^^Day 2
2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。 3、混合包装质粒和表达质粒如下： pCMV△R PCMV.VSV.G 表达质粒 2M CaCl2 无菌H2O 无菌2×HBS Use 10(ug) 10(ug) 20(ug) 75 (ul) 适量（ul） 600(ul) 总体积600ul 注意：先将各个组分加到离心管中，最后将2×HBS滴加到离心管中，防止局部浓度过高，混合均匀。
4、将混合好的复合物RT 5min，加入到细胞培养液中。
5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10?S+PS。
^^^Day 3
6、观察24h荧光。
^^^Day 4
7、早上10：00观察48h荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP管)。
Ooo感染细胞 ^^^Day 1
1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\\DMEM +10?S+PS，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。
^^^Day 2 2、感染时，37℃融化病毒储存液（病毒也需慢冻速溶），弃去细胞培养液，加入1000ul病毒液+1000ul 1640\\DMEM+10?S+PS+2ul Polybrene (10mg/ml) [Polybrene：培养液=1:1000]。(Polybrene: 聚凝胺,又名为溴化己二甲铵（hexadimethrine bromide），是一种阳离子聚合物。细胞培养中主要用于提高逆转录病毒感染细胞的效率，通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现。聚凝胺在蛋白质测序中也有一定作用。具有可高温高压灭菌特性。用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果)
3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\\DMEM +10?S+PS。过夜。
^^^Day 3
4、早上换2ml新鲜的1640\\DMEM +10?S+PS。
^^^Day 4
5、晚上观察48h荧光率。（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。
6、药筛：用嘌呤霉素（puro）
Puro:储存浓度：10mg\\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\\ml。
7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\\ml维持培养一周后改用1ug\\ml puro的培养基培养。