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课程：Glycobiology
蛋白质糖基化研究进展
姓名：马春 学号：2013113022
班级：生命科学与技术基地班
时间：2016.1.1
蛋白质糖基化研究进展
马春
（西北大学生命科学学院，陕西 西安，710069）
摘要：糖基化修饰是生命活动中最广泛、最复杂、也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。本文综述了糖基化的分类、在生命体中的作用、糖基化位点分析及糖链分析方法等。
关键词：蛋白质糖基化;分析方法
生命体是一种极其复杂且动态变化的有机系统，不断发生着各种生物化学反应，进行新陈代谢，并协调、控制各部分生物功能的发挥。蛋白质是生命体内各种生化反应的载体和生物功能的执行者，如分子识别、信号转导、免疫应答等。蛋白质功能的正常发挥保证着生命有机系统正确、有序、高效地运转。基因在转录和翻译后产生具有特定序列的氨基酸长链，即蛋白质的前体，再经过共价修饰、折叠、卷曲并形成特定的空间构象后，成为具有正常功能的成熟蛋白质。而共价修饰在这个成熟过程中发挥着重要的调节作用。不仅如此，蛋白质成熟后的许多关键功能，特别是涉及控制、调节等方面的功能，都是通过共价修饰实现的。这些发挥重要功能的共价修饰，就是蛋白质翻译后修饰它们使蛋白质的结构更为合理、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一。翻译后修饰可以发生在蛋白质的任一位点上，并且种类繁多，目前有文献报道的翻译后修饰就多达数百种，常见的有碟酸 化修饰、糖基化修饰、乙醜化修饰等。
蛋白质糖基化修饰是最广泛、最复杂、最重要的翻译后修饰之一，据推断有超过的蛋白质都发生了糖基化修饰。这些糖蛋白广泛分布于生命体中，特别是在细胞膜上和体液中含量丰富，大部分膜蛋白和分泌蛋白都是糖蛋白。糖基化修饰不仅影响蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。
1 糖基化类型
糖蛋白中的糖部分被称为聚糖。 而己糖则是聚糖中最常见的组分。 包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖以及他们的一些简单修饰形式，如葡萄糖的α-羟基被酰化氨基取代生成N-乙酰葡糖胺。 根据蛋白质被糖类修饰形式的不同可以把蛋白质糖基化分成以下四类： 1.2 N位糖基化
聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮连接而修饰蛋白质。 在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺，而且连接方式总是β构型。N 位糖基化根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。 在N位糖基化中Asn-Xaa-Ser ／ Thr（Xaa是除Pro外的任何氨基酸）被认为是N位糖基化的先决条件，不过少数情况下Asn-Xaa-Cys序列也可以糖基化。 1.1 O位糖基化：
聚糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的氧连接来修饰蛋白质。此糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上,但并没有发现特异的序列作为糖基化位点.O位多聚糖以逐步加接
单糖的形式形成低聚糖，但也有些只连接一个单糖的。 1.3 C位糖基化
一分子甘露糖基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环2号位C上，以此形式修饰蛋白质。 这种糖基化多发生在W-X-X-W W-X-X-C或者W-X-X-F序列的第一个色氨酸残基上。 在生命体中 ，这种糖基化并不多见。
1.4 糖基磷脂酰肌醇 （glycosylphosphophatidylinositol，GPI）锚定连接 糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphophatidyl i-nositol，GPI）锚定连接是指包含糖核心在内的GPI锚通过与蛋白C端部位结合把蛋白连接到细胞膜上。 不同GPI锚结构中的多糖成分是不同的。 GPI锚的一般结构主要是由乙醇胺，糖核心和肌醇连接而成，肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，乙醇胺则与蛋白质的羧基端相连。生物体中，许多蛋白质存在此类糖基化，包括一些水解酶、黏附蛋白、免疫蛋白、补体调节蛋白等。 当一个糖蛋白拥有多个糖基化位点或拥有多种结构的糖链时，会形成微观不均一性。微观不均一性影响着糖蛋白的结构与功能，对糖蛋白生物功能的控制与调节有着重要意义。此外，一个糖蛋白可能同时存在不同的糖基化修饰类型，例如许多糖蛋白都同时具有N-糖链和O-糖链，使糖蛋白能够发挥多种生物功能。 糖链是由一系列糖基转移酶催化合成的，每一种糖基转移酶都具有严格的底物和糖苷键专一性。N-糖基化合成起始于内质网，在核糖体进行mRNA翻译的同时，形成于内质网中的寡聚甘露糖链由糖基转移酶转移到肽链的特征序列上。之后经过一系列有序的加工和修饰，寡聚甘露糖链中的大部分甘露糖被切除，并由多种糖基转移酶依次加上不同类型的单糖分子，生成结构多样的N-糖链，最终在高尔基体中形成成熟的N-糖蛋白。O-糖基化合成则在高尔基体中进行，通常首先将一个乙酰半乳糖胺连接到肽链的Ser/Thr残基上，然后糖基转移酶依次将不同类型的单糖连接上去形成O-糖链。如同蛋白质的氨基酸序列由基因组编码决定，糖链的序列与结构是由一系列糖基转移酶决定的；但又不同于氨基酸序列，糖链合成没有固定的模板，与哪种糖基转移酶结合反应取决于蛋白结构及细胞微环境，属于非模板合成，因此糖链的结构及其所含信息比氨基酸序列更为丰富和复杂。
2 糖基化在生命体中的作用
蛋白糖基化是蛋白质翻译后修饰中最重要的修饰之一， 在生命体中起着非常重要的作用。在生物体中50%以上的蛋白质存在糖基化现象， 包括染色质蛋白、核孔蛋白、RNA 聚合酶 II、转录因子、蛋白翻译调控因子等等，涉及到细胞免疫、蛋白翻译调控、蛋白降解等许多生物过程。
2.1 参与免疫分子的成熟包装
未组装主要组织相容性复合体I类分子需要通过与天冬酰胺残基相连的糖链的帮助与内质网分子伴侣钙联素相互作用，然后此糖链与Clx分离,并与另一分子伴侣钙网素 相结合。 这两种分子伴侣或其中一种捕获二巯基氧化酶ERp57,使MHC I重链链内二硫键的形成。 同时MHC-I 的轻链β2M与重链相连接。而轻链β2M又与包括TAP运载体和跨膜糖蛋白tapasin在内的复合体相连。 外来的蛋白被细胞的蛋白酶体摄取并酶解成肽段， 然后被TAP结合并转运到内质网，使其与MHC I相连。结果导致MHC-I轻链与TAP，tapasin复合体解离。最终形成了成熟的MHC-I多肽复合体。 2.2 信号传导途径调控
II型糖尿病中 ，研究人员认为高血糖引起了异常的O-Glc NAc修饰， 导致一些信号事件被缓冲，使胰岛素受体底物下降，最终胰岛素不能很好的利用大量的葡萄糖。 蛋白O-GlcNAc修饰的水平对氨基己糖的生物合成途径非常敏感，可以把O-Glc NAc当作是能量（葡萄糖）可用性的感受器。 在这个模型中，O-GlcNAc修饰的状态和水平很大程度上依赖
与UDP-GlcNAc的可用性， 而且能表现出反映细胞营养状态的调节点。 如果O-GlcNAc修饰全面上升或下降，那这将对细胞对外界刺激的反应能力产生非常大的影响。 因此，O-GlcNAc修饰能被看成是细胞内的一种信号，它能很大程度上决定细胞如何去削减外界对自身的刺激。
2.3 参与细胞壁的合成
研究人员把构巢曲霉的编码甘露糖基转移酶的基因阻断了，结果导致甘露糖基转移酶的活性只有原来的6%，使一些蛋白无法糖基化，细胞发生异常现象，细胞壁无法正常形成。 2.4 蛋白降解调控
许多关键蛋白都受合成速率和降解速率控制。 而拥有PEST序列或者富含P、E、S、T残基的肽很容易被磷酸化或其他机制降解，而研究表明被O-Glc NAc糖基化的蛋白序列富含P、E、S、T残基而未被降解，这可能是因为蛋白的糖基化阻碍了其磷酸化，使蛋白不那么容易被降解。
2.5 参与蛋白质的翻译调控
真核起始因子eIF-2参与了蛋白质合成起始，但是它的磷酸化能抑制蛋白合成。Gupta 的实验室鉴定了一个能保 护eIF-2不受磷酸化的67k Da的eIF-2关联蛋白p67，他们后来发现这个p67蛋白有参与调控eIF-2活性的O-GlcNAc糖基化。把p67蛋白与一种凝集素WGA共培养后，发现抑制了p67蛋白保护eIF-2的能力，从而导致其磷酸化，抑制蛋白其始合成。 2.6 糖基化与疾病
一些疾病也被发现与糖基化异常有关。如第一个被鉴定为糖基化异常引起的疾病I-细胞病就是因为N-糖链不能进一步进行甘露糖-6-磷酸修饰而导致蛋白分解代谢失常所引发的一类贮积病 。在囊性纤维病中，也被证实存在异常糖基化：岩藻糖增多而唾液酸下降。 这也成了该病的一种标志。正因为某些疾病中存在着异常的糖基化现象，一些针对糖基化的抑制剂也已开始运用于到疾病的治疗试验中。 如α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡玻糖，米格列醇等被用于糖尿病治疗临床试验。N-丁基脱氧野尻霉素和6-0-丁基脱氧野尻霉素也都已被运用于治疗艾滋病的临床试验中。
3蛋白质糖基化分析方法
3.1 分离富集亲和技术 3.1.1 凝集素亲和技术
此法主要根据凝集素能特异性识别并结合一个或几个特异糖基这一性质，对糖蛋白进行的分离纯化。基本过程是先是让样品经过首次凝集素亲和层析，然后进行酶解，再把样品进行第二次凝集素亲和层析，最后再利用 HPLC 分离，进入质谱进行测序等。常用的凝集素主要有伴刀豆凝集素 A、麦芽凝集素、菜豆凝集素等。Kaji等曾利用伴刀豆凝集素亲合富集线虫中的糖蛋白，鉴定出了 N糖蛋白并确定了相当数量的糖基化位点。 3.1.2 肼化学富集法
肼化学富集法用酰肼试剂修饰经氧化处理的糖是一种传统的糖化学研究方法。一般要经过，氧化、连接、蛋白酶解、同位素标记、释放及分析等步骤。处理后的样品用毛细管液相色谱 - ES-I- MASS 或毛细管液相色谱 - MADLI- TOF- MASS 对糖肽进行分析和数据库检索。此法的显著优势在于可以一次收集不同类别的糖类。 3.1.3 亲水色谱法
亲水色谱是一种采用极性固定相和非极性流动相的色谱技术。目前已有报道将此法与凝集素亲合技术结合利用凝胶电泳进行糖肽的分离富集，这种方法利用了糖链的加入使糖肽的亲水性增强的原理进行的。 3.1.4 β- 消除米氏加成反应