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土壤酸性磷酸酶活性的测定
1．试剂配制
(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液
取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。
(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）
原液由以下成分组成:
三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g
溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯
(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：
36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤
取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。
培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3．计算方法
土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示， W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t）
式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）； t —反应时间（h）；=1h m—样品土壤的重量（g）
无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。
标准曲线的制作：
1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。 2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O溶液1ml，NaOH溶液4ml，
②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量n（mg）=a+b×A410.
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）
1、试剂配置
（1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖（m:v=8:100）
（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g Na2HPO4·12H2O溶于1L蒸馏水中）50ml加1/15M磷酸二氢钾（9.073g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）950ml即成。 （3）葡萄糖标准液（1mg/ml）
预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 （4） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）
称2.5g二硝基水杨酸，溶于100ml 2mol/L NaOH（20g定容250ml）和250ml水中，再加150g酒石酸钾钠，用水稀释定容至500ml（棕色瓶保存，保存期不过7天）。 （5) 甲苯
2、操作步骤
（1）标准曲线绘制
分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于试管中，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，于50ml容量瓶定容后以空白管调零在波长508nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定
称取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后（160r振荡10min），放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml DNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，用15ml蒸馏水代替15ml8%蔗糖溶液；整个试验需做无土壤对照用5ml蒸馏水代替5g土壤，每批土样做2个；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）
3、结果计算：蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。
蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m =4
a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重
土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）
一、试剂配制
1、甲苯（分析纯）
2、10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。(当天做当天配)
3、柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。
4、苯酚钠溶液：A.62.5苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5、次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。 标准溶液： （1） 称0.4717克硫酸铵（105℃烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。 （2）将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、 5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50毫升使溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
二、分析步骤
1 称2～5克过20目风干土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液（对于有土对照的加入10ml去离子水和20mlpH6.7柠檬酸盐缓冲液），摇匀后，在30℃恒温箱中培养24小时，过滤。
2 取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20分钟后定容，在分光光度计波长578毫微米处比色（1cm比色杯）。反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。还需减去无土基质（尿素＋柠檬酸盐）。
三、结果计算：
脲酶活性以24小时内每克土中氨态氮的毫克数来表示。
NH3-N（mg/1g土24h）=（浓度×稀释倍数×比色体积）÷（1000×干土重） 1000为ug换算成mg
紫外分光光度法测过氧化氢酶活性
一、试剂配制
（1）0.3%过氧化氢溶液：2.5ml 30%过氧化氢溶液定容250ml。 （2）1.5mol·L-1硫酸溶液：42ml定容500
（3）饱和明矾：20摄氏度时的溶解度为10.84g，30摄氏度时为15.41g
（4）0.02mol·L-1高锰酸钾溶液：称取3.16g高锰酸钾定容1L，其准确浓度用标准草酸钠标定。
二、测定步骤
称取土样2.00g于100ml塑料瓶，加40ml蒸馏水，加入5ml0.3%的过氧化氢溶液，振荡20min（200r/min）。取下后立即加入饱和明矾1ml，立即过滤于盛有5ml1.5mol·L-1硫酸溶液的三角瓶中，滤干后直接在240nm下比色测定吸光值As。并做无土A0和无基质Ak对照。
三、结果计算
以每20min内土壤分解的过氧化氢的毫克数表示酶活性，公式为：
E=Ae×T/W,Ae=A0-As+Ak,T=CV×867/(A0×V0)
E是过氧化氢酶活性，W为土壤重，T是单位吸光度相当于过氧化氢的毫克数，A0是无土对照即空白溶液的吸光值，Ak是无基质溶液的吸光度，As是样品溶液的吸光度，C是高锰酸钾溶液的浓度，V是吸取V0ml的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液的体积。