发布时间 : 星期日 文章分子生物学实验指导(精)更新完毕开始阅读
[作业]
1.步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么?将得出的结论填写在《实验报
告册》上。
2．提取鸡血中的DNA时,为什么要除去血液中的上清液?
3. 步骤1和步骤3中都需要加入蒸馏水,两次加入的作用相同吗?为什么?
8
实验四 质粒DNA的制备
[实验目的]
通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒。
[实验原理]
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复PH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
[实验仪器与设备]
1.恒温培养箱 2.恒温摇床
3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机 5.高压灭菌锅 6.超净工作台 7.微量移液器 8.eppendorf tub、tip
[实验材料]
1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿 9.乙醇 10.胰RNA酶 11.氨苄青霉素 12.蔗糖 13.溴酚蓝 14.酚 15.β巯基乙醇 16.盐酸 17.含pUC18质粒的大肠杆菌
9
附：试剂的配制
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0) 10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合 3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL 4.TE缓冲液
10mmol/L Tris· HCl 1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回) 6.胰RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100 ℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20 ℃。 7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚 8.酚
[实验步骤]
(一) 提取质粒
1．将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2．取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。 3．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4．将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。 5．加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），混匀内容物，将离心管放冰上5 min。 6．加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。 7．1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。
8．向上清中加入等体积酚：氯仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.
10
9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
10．用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
11．加50μL TE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
（二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA 方法参见实验二
[作业]
1. 碱裂解法提取质粒DNA 的原理是什么？
2. 用凝胶成像系统拍照质粒DNA电泳图，并分析电泳所得条带
11