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提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
提示：基本操作如下：
（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。
（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。
（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。 （二）求异思维
你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？
提示：1970年，特明（H.M. Temin）和巴尔的摩（D. Baltimore）证实了RNA病毒中含有一种能将RNA转录成DNA的酶，这种酶被称为依赖RNA的DNA聚合酶，由于与中心法则中的从DNA到RNA的转录是反向的，所以称为反转录酶（reverse transcriptase）。
反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA（图1-3）。
图1-3 由mRNA反转录形成cDNA的过程
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cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
（三）寻根问底
1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？
提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
2.将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。
五、 知识拓展
1.PCR的扩增过程是怎样的？
PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。
第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。
第二步：将反应体系降温至55～60 ℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。
第三步：将反应体系升温至70～75 ℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2.如何从基因文库中找到所需要的基因？
从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。
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第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。
第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。
第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。
第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。
第五步，从该菌落中再提取目的基因。
3.基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。
（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。
（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。
（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。 4.什么是分子杂交技术的显示带？
分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术，主要用于检测和鉴定，可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。常用的技术有：
Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，就需要通过Southern杂交技术。基本做法是：第一步，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。
Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与Southern杂交相同。
Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。 1.3 基因工程的应用
一、 教学目标
1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。
3.认同基因工程的应用促进生产力的提高。
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二、教学重点和难点 1.教学重点
基因工程在农业和医疗等方面的应用。 2.教学难点 基因治疗。 三、教学策略
1.加强收集信息和处理信息环节的指导。
基因工程的应用是基因工程基本操作程序的一个必然结果。如果本节只作为成果的学习，那么就显得思维力度不足了。为此，建议加强指导学生收集和处理信息这一环节。具体做法如下：
无论是学习转基因植物方面的应用，还是学习转基因动物方面的应用，乃至转基因工程菌生产药物方面的应用，首先必须寻找目的基因。教师可利用表1-1，指导学生整理课本中提供的信息，填写此表。这样做既可以调动学生学习的积极性，也增强了他们分析和处理信息的能力。
表1-1 转基因生物与目的基因的关系 转基因生物 抗虫棉 抗真菌立枯丝核菌的烟草 抗盐碱和干旱作物 耐寒的番茄 抗除草剂大豆 增强甜味的水果 甜味基因 生产胰岛素的工程菌 目的基因 Bt毒蛋白基因 几丁质酶基因和抗毒素合成基因 调节细胞渗透压的基因 抗冻蛋白基因 抗除草剂基因 降低乳糖的奶牛 肠乳糖酶基因 人胰岛素基因 目的基因从何来 苏云金芽孢杆菌 鱼 人 指导学生提高处理信息的能力，还可以体现在对教材内容的重组上。例如，我们可以解决当前世界上存在的重大问题作为主题，如以解决“粮食”、“环境污染”、“能源危机”、“攻克不治之症”等问题作为主题，让学生将课文中的知识或学生知道的课外的基因工程应用方面的知识进行重组。这样的活动不仅培养了学生处理信息的能力，还会使学生感悟到肩负的社会责任，从而激发用科学技术报效祖国的志向。
2.课文中的一些难点，建议采用小组讨论，师生共同归纳的方法学习。
课文中有几处是学生学习感兴趣的知识，但文字说明不多，学生学习有一定难度。例如 “什么叫乳腺生物反应器”、 “什么叫工程菌”、 “什么是基因治疗” 等。教师可创设问题情境，让学生讨论，加深用已有知识认识新事物的能力。学生想不到的地方，可由师生共同归纳。例如，学习乳腺生物反应器时，学生提出“给我们讲讲乳腺生物反应器究竟是怎么回事”。这时教师可提出以下问题，让学生讨论。
（1）用动物乳腺作为反应器，生产高价值的蛋白质（如教材中列举的血清白蛋白、抗凝血酶等）比工厂化生产的优越之处有哪些？
（2）用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？
第一个问题，既可以解决乳腺生物反应器的优越性问题，而且显示了社会需求是乳腺生物反应器这一创新成果产生的动力。学生在充分讨论和发表观点的基础上，师生共同归纳出乳腺生物反应器的优点：①产量高；②质量好；③成本低；④易提取。
第二个问题，用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程与转基因动物操作过程相同。而不同之处可由教师提出：为了将目标产品在奶中形成，需要使用乳腺组织中特异表达的启动子，要在编码目的蛋白质的基因序列前加上乳腺组织中特异表达的启动子构建成表达载体。
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