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实验八 饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
一、实验目的
1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。 2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。 3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理
咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：
OH3CNONCH3NNCH3
在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂
1.岛津LC-20A高效液相色谱仪
2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。 3. 咖啡因标准溶液的配制
（1）标准贮备液 配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。 （2）标准系列溶液 用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样 市售的可口可乐和百事可乐
四、实验条件
1. 色谱柱（XDB-C18） 颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm 2. 流动相 甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min 3. 检测器 紫外光度检测器，270 nm 4. 进样量 10 uL
五、实验步骤
1. 制备所需的流动相，有机溶剂用0.45μm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45μm的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.
2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.
3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。根据分析要求设定柱温箱的温度，没有柱温要求的，设为25℃。
4. 待检测器波长检测：出现“CHECK GOOD”，仪器自检完成。此时打开A泵、B泵的[ DRAIN ]阀，用脱气后的流动相依次进行purge。关闭A泵、B泵的[ DRAIN ]阀。
5. 清洗进样阀。用脱气后的流动相在进样阀的LOAD状态及INJECT状态下来回几次彻底清洗。清洗后进样阀停留到LOAD状态。
6. 根据分析要求，在A泵按[ func ]输入流量按[ enter ]确认，按[ conc ]输B泵的浓度按[ enter ]确认后按[CE]返回初始界面。开始泵的运行。 7.待仪器稳定后，按标准溶液浓度递增的顺序，由稀到浓依次等体积进样10ul（每个标样重复进样3次），准确记录各自的保留时间。
8. 同样取10ul待测饮料试液进色谱分析（重复3次），准确记录各个组分的保留时间。
9. 根据标准物的保留时间确定饮料中的咖啡因组分峰，计算系列咖啡因标准物和待测咖啡因的峰面积（3次平均值）。
10. 以标准物的峰面积对相应浓度做工作曲线。11.
11. 实验结束后做好仪器使用情况登记，经实验指导老师签名后方可离开实验室。
六、实验数据及处理
1. 处理色谱数据，将标准溶液及试样中咖啡因的保留时间及峰面积列于表中。 标准溶液10 ug/mL 标准溶液20 ug/mL 标准溶液40 ug/mL 标准溶液60 ug/mL 标准溶液80 ug/mL 标准溶液100 ug/mL 可口可乐 百事可乐 保留时间tR/min 峰面积A/mV·s 2. 用相关软件绘制咖啡因峰面积－质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。
3. 根据试样溶液中咖啡因的峰面积值，计算可口可乐和百事可乐中咖啡因的质量浓度。
七、思考题
1. 解释用反相柱（ODS）测定咖啡因的理论基础。 2. 能否用离子交换色谱柱测定咖啡因？为什么？
六、实验数据及处理 1.处理色谱数据。
表一：标准溶液的实验数据
浓度?g/mL 组号 10-1 10 10-2 10-3 平均值 20-1 20 20-2 20-3 平均值 40-1 40 40-2 40-3 平均值 50-1 50 50-2 50-3 平均值 60-1 60 60-2 60-3 平均值 保留时间tR/min 4.782 4.784 4.786 4.784 4.786 4.787 4.786 4.786 4.786 4.787 4.788 4.787 4.785 4.789 4.787 4.787 4.868 4.789 4.791 4.816 峰面积A/mV?s 189556.3 201204.9 192967.8 194576.3 357779.6 368395.1 371051.3 365742.0 695127.3 702897.0 685887.6 694637.3 957336.9 947785.9 944831.8 949984.9 1081735 1106350 1066589 1084891 峰高 11574.2 12198.6 11735.6 11836.1 21735.2 22277.9 22449.7 22154.3 42265.3 42691.2 41805.7 42254.1 57290.3 56727.9 56453.7 56824.0 64867.9 66384.1 64061.7 65104.6 表二：试样溶液的实验数据
名称 编号 1 百事可乐（1mL） 2 3 平均值 1 可口可乐（1mL） 2 3 平均值 保留时间tR/min 4.794 4.793 4.793 4.793 4.794 4.797 4.799 4.797 峰面积A/mV?s 216430.6 221488.6 220618.0 219512.4 193551.9 192648.3 196739.2 194313.1 峰高 12697.4 12937.3 12930.6 12855.1 11272.9 11268.4 11492.4 11344.6 2.绘制咖啡因峰面积-质量浓度的标准曲线，并计算回归方程和相关系数。
表三：绘制咖啡因标准溶液峰面积-质量浓度的标准曲线数据