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防治哈密瓜细菌性果斑病拮抗酵母菌的筛选及其生防机理研究
Selection and Mechanism of Action of Antagonist Yeast Against Bacterial Fruit
Blotchbiosynthetic Genes
【作者】 王晓东；
【导师】 李国庆；
【作者基本信息】 华中农业大学， 植物病理学， 2009， 博士
【摘要】 由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)引起的哈密瓜果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是瓜类生产中一种毁灭性细菌性病害。目前在瓜类作物中无免疫品种。虽然化学防治对该病有一定的防治效果,但是大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留,以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治被认为是一种合理而又安全的防治手段。探讨利用酵母菌防治哈密瓜细菌性果斑病是非常必要的。本论文从拮抗酵母菌的筛选、防效评估、拮抗酵母菌菌株的鉴定、发酵体系、抑菌物质的理化性质、以及抑菌机理等方面进行了系统研究,获得如下研究结果:1、从湖北武汉、河南信阳和新疆石河子采集的植物和土壤等样品中分离获得463株酵母菌。经过平板抗生性测定和盆栽活体试验,成功筛选出一株有效防治哈密瓜细菌性果斑病的拮抗酵母菌菌株0732-1。2、在温室试验中,用酵母菌0732-1发酵液处理带菌哈密瓜种子,能显著降低Aac对哈密瓜幼苗的侵染。在第一次试验中,使用0732-1、农用链霉素和盐酸处理带菌种子的发病率分别为2.8%、0和2.6%,对照发病率为97.6%。在第二次试验中,发病率分别是7%、8.8%和3.7%,对照发病率为83.3%。两次试验中防病效果三者间无显著差异(P＞0.05)。在田间试验中,酵母菌0732-1发酵液(1×10~7cfu/ml或1×10~9cfu/ml)能有效降低哈密瓜细菌性果斑病的危害。另外,酵母菌0732-1先于Aac接种的防效优于同时接种酵母菌和Aac的防效。在哈密瓜幼苗灌根施用中,酵母菌0732-1无显著防病和促生的效果。3、根据形态特征、营养代谢特征、生理生化特性、以及ITS-5.8S rDNA片段序列分析(GenBank数据库中登录号为EU380207),将酵母菌0732-1鉴定为Pichiaanomala。4、酵母菌0732-1能利用8种碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、柠檬酸钠、乳糖、甘油和乙醇)和6种氮源(硫酸铵、硝酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硝酸钾、蛋白胨)进行生长和繁殖,并能产生抑制Aac的抗细菌物质(antibacterial substances,ABS)。其中6种碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乙醇和甘油)和4种氮源(硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钾和蛋白胨)适于产生ABS。最适碳源为果糖。磷酸二氢钾(29.39 mmol/L)有利于酵母菌0732-1产生ABS。5、酵母菌0732-1抑菌谱广,对供试17种真菌和4种细菌具有抑制效果,其中6种真菌和1种细菌(Aac)是侵染瓜类植物的病原菌。因而,此酵母菌具有防治多种瓜类植物病害的潜质。6、通过单因素试验对酵母菌0732-1产生ABS的条件进行了研究。试验结果表明:酵母菌0732-1产生ABS的最适环境条件是:初始pH值为9.0;装样量为80 ml(250 ml三角瓶);接种量为10%;温度20℃;培养96 h后,发酵液中的ABS抑菌活性达到最大。7、酵母菌0732-1产生的ABS可能是一类耐热、耐酸、抗紫外线的非蛋白极性物质。当环境pH高于9.0时,抑菌活性完全丧失。采用硫酸铵分级沉淀和有机溶剂萃取不能从发酵液中分离出ABS。利用蒸馏法可以得到部分ABS。8、试验证实:酵母菌0732-1的防病机制包括抗生作用和诱导寄主抗性。酵母菌0732-1在培养过程中能产生大量的ABS,并能对Aac具有明显抑菌作用;施用该菌及其发酵物均能提高哈密瓜幼苗体内3种防卫反应相关酶(POD、PAL和CAT)的产生。同时还发现酵母菌0732-1在大田条件下,能迅速定殖于哈密瓜叶片和果实表面上。在瓜叶上接种15 d后,种群为1.2×10~5cfu/cm~2;在哈密瓜幼果上接种10 d后,种群数量为1×10~7cfu/cm~2。虽有下降,但趋势波动不大。上述研究结果为进一步开发利用酵母菌0732-1防治哈密瓜细菌性果斑病奠定了基础。 更多还原
【Abstract】 Bacterial fruit blotch（BFB） caused by Acidovorax avenae subsp.citrulli（Schaad et al.） Willems et al.（Aac） is a serious disease threatening the watermelon industry.So far, there are no available commercial cultivars of cucurbit crops resistant to the disease. Although some bacteroicides could be used to control BFB,consumers concern
over the bactericides contamination to environment and residues of bacteroicides in watermelon. Therefore,it is necessary to develop alternative control methods to re... 更多还原
【关键词】 哈密瓜； 细菌性果斑病； 生物防治； Pichia anomala； 抗细菌物质；
【Key words】 Hami melon； bacterial fruit blotch； Pichia anomala； antibacterial substance； mechanism of action；
果实采后病害生物防治及其机理研究
【作者】 范青；
【导师】 田世平； 荆玉祥；
【作者基本信息】 中国科学院植物研究所， 植物学， 2001， 博士
【摘要】 分离和筛选了5种能有效防治采后果实病害的拮抗菌。其中，季也蒙假丝酵母（Candida guiliermondii（Cast）Langeroret Guerra）从引种拮抗菌中筛选获得，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B-912从土壤中分离筛选获得，膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens hansen）从桃果实伤口上分离获得，隐球酵母（Cryptococcus albidus（Saito）Skinner）和丝孢酵母（Trichosporon sp.）从桃果实表面分离获得。本文主要研究了这些拮抗菌对桃、油桃、苹果、梨和柑桔等我国主要水果采后病害的防治效果，并对其可能的抑菌机理进行了初步研究。结果如下：1．5×108CFU/mL的C.guiliermondii和P.membranefaciens悬浮液可完全抑制病菌孢子浓度为5×104个/mL时桃和油桃果实软腐病（Rhizopus stolonifer（Ehrenb.ex Fr.）Vuill.）在25℃，15℃和3℃下的发生。1×108CFU/mL的C.albidus和Trichosporon sp.悬浮液可完全抑制孢子浓度分别为1×105个/mL和5×104个/mL时苹果灰霉病（Botrytis cinerea）和青霉病（Penicillum expansum）在23℃-25℃和1℃下的发生。C.albidus和Trichosoporon sp.对梨灰、青霉病也有一定抑制效果。B-912对柑桔果实青霉病（Penicillium italicum）、绿霉病（Penicillium digitatum）和核果类果实褐腐病（Monilinia fructicola）也有极好的抑制效果。生物防治效果与拮抗菌的浓度成正比，与病菌孢子浓度成反比。2．结抗酵母菌在室温和冷藏条件下都能迅速在果实伤口定殖，接种酵母菌48h后，数量可增加20倍以上。拮抗菌和病菌孢子的接种时间与生物防治效果有关，先接种拮抗菌的抑菌效果显著地好于同时或后于病菌接种的效果。3．温度对拮抗酵母菌的抑菌活力没有明显影响，无论是在室温还是在冷藏条件下，拮抗酵母茵都有同样的抑菌效果。但拮抗细菌B-912的抑菌效果与温度有一定关系。较高的温度有利于细菌拮抗作用的发挥。4．桔抗菌能与常规的果实采后处理措施如钙处理、化学杀菌剂、冷藏和气调贮藏相结合。酵母菌与2％ CaCl2配合能明显地增强其抑菌能力；拮抗菌与低浓度的杀菌剂如扑海因混合使用，可达到高浓度杀菌剂的抑病效果；C.albidus和Trichosporon sp.对果实采后气调贮藏环境有良好的适应性，它们在气调下对采后苹果、梨的灰霉病和青霉病的抑制效果比冷臧条件下的好。5．细菌 B－912的抑菌机理与其产生抗菌素有关，B．gi 2的滤液在 in vitro上能有效地抑制病菌抱于的萌发，在 in vivo上也能明显地抑制果实采后病害的发生。桔抗酵母菌的抑菌机理则较复杂，但主要与病菌竞争营养有关，同时，C．gualiermondii和P。embran吵ciens对软腐菌的抑制还通过产生水解酶如pl，3。葡聚糖酶和几丁酶与病原茵直接作用，并参与诱导寄主产生抗性等。 更多还原
【Abstract】 Fan Qing (Plant Pathology) Directed by Professor Tian Shiping and Professor Jing YuxiangFive antagonists were selected to study the biocontrol efficacy of postharvest diseases of fruits. Candida guiliermondii(Cast) Langeroret Guerra was screened from introduced strains. Bacillus subtilis B-912 was isolated from soil. Pichia membranefaciens hansen was isolated from wound of peach fruits, while Cryptococcus albidus (Saito) Skinner and Trichosporon sp. were isolated from the surface of peach fruits... 更多还原
【关键词】 采后病害； 果实； 生物防治； 拮抗菌； 抑菌机理；
【Key words】 Postharvest diseases； Fruits； Biological control； Antagonist； Mode of action；
拮抗菌对冬枣采后病害的生物防治
Biological Control of Postharvest Diseases of Jujube Fruit Using Antagonists
【作者】 薛梦林；
【导师】 张继澍； 张力群；
【作者基本信息】 西北农林科技大学， 植物学， 2006， 博士
【摘要】 本文以冬枣采后保鲜效果为前提,以生物防治冬枣采后病害为宗旨,研究了冬枣采后病害的发生,并对其主要病原物进行了鉴定;随之以引发采后主要病害的病原物为靶标,在枣果上进行了拮抗菌的筛选;拮抗菌分类地位的鉴定;进一步对拮抗菌抑制冬枣采后病害的效果开展了研究,并对其产生的生防潜力进行了拮抗机理的初步探索。结果如下:本研究以不同地区枣果主栽区的冬枣为试材,在2004-2005连续两年对其采前和采后侵染病果进行了多批次分离,依据柯赫氏法则对所分离的病原菌进行了致病性测定。通过对不同致病菌株及其近源属种的核糖体5.8S rDNA及其侧翼ITS1和ITS2区的核苷酸序列分析,结合形态观察的方法,发现引起冬枣采后病害的病原物主要有细交链格孢(Alternaria alternata)、多隔镰孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)、扩展青霉(Penicillium expansum)和美澳核果褐腐串珠霉(Monilia fructicola)。冬枣采后病害的生物防治,以主要病原菌细交链格孢为靶标筛选拮抗菌。基于拮抗菌在生境位的适应能力和有效定殖,从枣果面和伤口分离和筛选拮抗菌。通过活体(in vivo)的方法,筛选到4种对A. alternata有较好生防效果的拮抗菌,其中一种为拮抗细菌B501,另3种为拮抗酵母菌XY103,XY201和XY801。拮抗细菌和拮抗酵母菌分别依据核糖体16S rDNA和26S D1/D2及ITS区核苷酸序列的比较,结合表型特征的观察和生理生化特性的测定,B501被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans);拮抗酵母菌XY103, XY201和XY801分别被鉴定为梅奇属(Metschnikowia)酵母的3个新种Metschnikowia sinensis sp. nov., Metschnikowia zizyphicola sp. nov.和Metschnikowia shanxiensis sp. nov.由于这4种拮抗菌都是首次从枣果表面分离,特别是酵母菌为3个新种,因此对其生防潜力进行了系统的研究。本研究采用枣果刺伤接种和浸泡接种两种方法,对成团泛菌B501和梅奇酵母新种M. zizyphicola XY201进行了抑病效果试验。结果表明,成团泛菌B501以低的浓度1×107 cfu mL-1可有效控制由细交链格孢引发的冬枣病害,其发病率控制在20%以下,显著地好于浓度为1×105cfu mL-1和对照;梅奇酵母种XY201以浓度1×10~6cfu mL-1或1×107 cfu mL-1使用时,可使该病害的发生率控制在8%以下,与浓度为50μg mL-1的化学杀菌剂扑海因防效相当。同时发现,梅奇酵母种XY201对冬枣采后其它病原物多隔镰孢霉(F. decemcellulare Brick)、扩展青霉(P. expansum)和美澳核果褐腐串珠霉(Mon. fructicola)都有显著的抑制效果。这表明梅奇酵母种XY201是一株有效的广谱性拮抗菌。这两种拮抗菌的生防效力可以通过改良剂氯化钙而得以提高,而且与 更多还原
【Abstract】 This study focuses on the biological control of the postharvest diseases on the jujube fruit, including isolation and identification of the pathogens on the postharvest jujube fruit, screening of microbal antagonists against A. alternata isolated from jujube fruit, and investigation on the biological control effect and the action mode of antagonists against postharvest diseases.Jujube fruits (Zizyphus jujuba cv. Dongzao) used in this study were collected from several orchards in September and Oc... 更多还原
【关键词】 冬枣(Zizyphus jujuba cv. Dongzao)； 采后病害； 拮抗菌； 生物防治； 核糖体DNA；
【Key words】 Jujube (Zizyphus jujuba cv. Dongzao)； Postharvest disease； Biological control； Antagonist； Ribosomal DNA；
生防制剂在葡萄保鲜中的应用与抑菌机理研究
Studies on the Application and Antagonistic Mechanism of Biocontrol
Medicament in the Storage of Grapes
【作者】 秦丹；
【导师】 石雪晖；
【作者基本信息】 湖南农业大学， 果树学， 2007， 博士
【摘要】 葡萄（Vitis vinifera L.）采后微生物病害会导致巨大经济损失,以往葡萄果实采后病害的防治主要采用硫处理的方法,但长期大量使用化学杀菌剂会使致病菌产生抗药性,同时会对人体健康及环境造成危害,因此迫切需要寻找一种有效而无害的防治方法。以有效微生物取代化学杀菌剂用于果蔬采后病害的防治已显示出巨大的应用前景,并成为一个新的研究热点。研究微生物杀菌剂取代化学杀菌剂进行葡萄果实采后病害的防治,对于减少葡萄果实中硫的残留,保护环境,保证食用安全性具有重要意义。本研究从已筛选出的对葡萄果实采后病害具有拮抗作用的酵母菌中,选择抑菌效果最好的菌种制备生防制剂。对比了不同拮抗酵母抑制灰霉葡萄孢的效果以及在葡萄果实表面的生长性能。探讨了拮抗酵母的抑菌机理,研究了拮抗酵母制剂的制备方法,并摸索了提高生防制剂对葡萄果实采后病害抑制效果的措施。主要研究结果如下:1.通过in vivo试验发现:在所选的拮抗酵母中,季也蒙毕赤氏酵母抑制灰霉葡萄孢的效果最好,腐烂率为空白对照的18%左右,并且可以在新鲜葡萄果实表面快速生长,具备开发成葡萄生防制剂的潜力。2.通过混菌培养、对比拮抗酵母各处理液抑菌效果以及检测酵母无营养培养基中β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶的活性情况证实:季也蒙毕赤氏酵母并非通过分泌抑菌物质来发挥抑制致病菌的作用,而是通过营养与空间竞争来抑制灰霉葡萄孢。3.普通光学显微镜和扫描电镜观察发现:季也蒙毕赤氏酵母能够吸附在灰霉葡萄孢的菌丝体上,但季也蒙毕赤氏酵母培养滤液中不含抑菌成分,季也蒙毕赤氏酵母与灰霉葡萄孢的无营养培养液中没有检测出几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性。上述结果均不支持重寄生的判断,从现有研究中尚未能证实季也蒙毕赤氏酵母与灰霉葡萄孢间存在寄生关系。4.通过在葡萄果实上接种微生物,观察葡萄果实中抗病酶系（几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶）的活性变化规律,研究拮抗酵母菌对果实抗病性的诱导作用,结果表明:拮抗酵母未能显著提高葡萄果实抗病性酶系的活性,诱导果实抗性也并非季也蒙毕赤氏酵母抑制灰霉葡萄孢生长的方式。5.通过营养源单因素筛选,结合培养基正交试验发现:在PDB培养基中加入果糖18g/L,酵母膏2.0g/L,尿素2.0g/L,L-D-L-亮氨酸
0.2g/L,KH2PO45.5g/L,MnSO44.5mg/L,ZnSO4 25 mg/L,烟酰胺0.4mg/L,肌醇120mg/L对季也蒙毕赤氏酵母进行增值培养,可以使酵母增值明显高于普通PDB培养液,该配方可作为生产培养液配方。6.选择接种量、培养时间、通风量、搅拌速度作为影响因素在小型发酵罐中进行中试发酵试验,结果表明:采用培养温度28℃、初始pH 4.0,接种量6%、培养时间30h,通风量2.0 V.V.m（m3空气/m3发酵液·min）,搅拌速度100rpm的发酵工艺对季也蒙毕赤氏酵母进行增值培养,鲜酵母产量最高。7.选择活性干酵母常用保护剂和载体,生产季也蒙毕赤氏酵母干粉,通过测定一定贮藏期内干粉中酵母的存活率,确定最佳保护剂和载体。结果表明:选用山梨醇2%+蔗糖酯4%+PG 0.45%作为季也蒙毕赤氏酵母保护剂,奶粉作为载体制备酵母干粉制剂,可以使酵母菌存活率最高。8.采用热风干燥、真空干燥、微波干燥、离心喷雾干燥、冷冻升华干燥等工艺生产酵母干粉,对比干燥后酵母的存活率后发现:冷冻升华干燥可以使酵母干燥后达到91.6%的存活率,最有利保持酵母制剂活性。9.通过测定酵母干粉在贮藏期中所含酵母的存活率,发现采用本研究中选取的培养液、发酵工艺和干粉制备方法制得的活性干酵母制剂具有1年以上的有效期,将其应用于葡萄果实的贮藏,结果表明:单独使用该制剂,在使用浓度为1%,冷藏三个月后,可使葡萄果实腐烂率下降18%。10.将各种提高葡萄果实抗病性的措施与拮抗菌结合,在葡萄果实上进行invivo试验,结果表明:NaHCO3、CaCl2处理,微波处理、热激处理、涂被、水杨酸（SA）诱导等措施均不能显著提高季也蒙毕赤氏酵母的抑菌能力,而低剂量的化学防腐剂,能够显著提高酵母制剂对葡萄果实采后病害的防治能力,用0.025%的富马酸二甲酯加0.3%的茉莉酸甲酯（MeJA）加1%的季也蒙毕赤氏酵母制剂处理的葡萄果实,在冷藏4个月后,腐烂率比季也蒙毕赤氏酵母制剂单独处理葡萄低48%,比硫处理腐烂率高13%,达到了实用水平。 更多还原
【Abstract】 Postharvest dieases of grapes have lead huge losses. Anciently, these diseases are primarily controlled by application of methodssulfur dioxide. The widespread usage of synthetic fungicides exists the chemical residues, environment pollutions, fungicide-resistant by pathogens, etc, many malpractices. Alternative methods which was