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1 前言
乳酸菌是自古以来就被人类作为食品微生物利用的一大类菌，广泛应用于发酵乳制品、医药、轻工业和畜牧业等领域。近几年来，透过传播媒体，乳酸菌对人体的益处包括整肠，帮助消化,甚至抑制幽门杆菌，解决胃胀气等功能林林总总，不再赘言。但乳酸菌能对人体健康产生贡献，其前提是乳酸菌必须具有足够的活性，才能对人体产生作用。何谓足够的活性？第一，乳酸菌是活的而且能稳定持久，维持生命力；第二，浓度够高；第三，耐胃酸且能在肠内定殖。
乳酸菌根据其包埋技术的演进的四种型态
市面上常见的乳酸菌根据其包埋技术的演进大致可分为四种型态： 第一型：未经包埋处理的乳酸菌；不耐酸、不耐久存。
第二型：巨包埋型乳酸菌；一般是利用硬胶囊包裹，保护乳酸菌通过胃部，但是不易溶解，而且应用范围窄，只能用在胶囊型商品上，同时不耐久存。
第三型：微胶囊包埋型乳酸菌；利用凝胶作为包覆材以微包埋方式包覆，耐久存、耐胃酸，但是热稳定性不好，同时凝胶不易溶解，在肠道中需要六小时左右才能溶解释出， 因此一般只用在双歧杆菌的包埋，而且价格十分昂贵。
第四型：双层包埋型乳酸菌 DUOLAC；最新型包埋技术处理，不仅耐久存、耐胃酸，到达肠道后立即释出，任何益生菌都可以利用该技术包埋。而且包覆材内含天然纤维寡糖益生物质，可以帮助乳酸菌在肠道内定殖，同时DUOLAC双层包埋乳酸菌的菌种来源限制严格，必须来自只喝母奶的东方人种婴儿。因此DUOLAC乳酸菌完全符合前述筛选优良乳酸菌的五项原则，而且价格与一般未经包埋的乳酸菌相当，绝对称得上是价廉物美。
本实验采用双层包埋方法 ,内层用牛奶蛋白包埋 ,外层用κ-卡拉胶和刺槐豆胶进行包埋 ,用这种双层材料包埋乳酸菌 ,包埋剂在强酸性的胃酸中凝结 ,保护乳酸菌 ,等到益生菌进入较高 pH值十二指肠时 ,包埋剂自然分解溶化 ,释放益生菌 ,第二层的牛奶蛋白促进乳酸菌与肠壁纤毛附着,其双层包埋剂保护乳酸菌不受胃酸的侵蚀而安全到达小肠、 大肠后定殖产生功效 ,同时牛奶蛋白提供营养于乳酸菌 ,可有效保持乳酸菌在各种条件中的高生物活性。通过双层包埋技术后的乳酸菌具有耐久存性；耐胃酸、胆盐性；热稳定性。
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2 材料与方法
2.1材料与设备
乳酸菌种为嗜酸乳杆菌L.acidophilus 和干酪乳杆菌L.casei (粉状) TA培养基(改良番茄汁琼脂培养基 ),乳酸菌落数测定用 纯牛奶为厦 门心鲜乳业有限公司提供 k‘一卡拉胶 、刺槐豆胶(化学纯)、 显微镜XSP-2XC[3A]为上海光学仪器六厂生产, 生化培养箱为SPX-2508生化培养箱 ,上海福玛设备有限公司生产； 冷柜为BCD-198冷冻冷藏箱 ,广东顺得中宝冷橱具设备厂产品及手提式高压蒸汽灭菌锅 。 2.2 试验方法［2］
乳酸菌活菌数目检测 (cfu/mL )【2】TJA 培养基 (改良番茄汁琼脂培养基 ),采用稀释平板菌落计数法进行菌落计数 。
存活率=测 出的菌落数/ 起始菌落数
2.2-1 双层包埋乳酸菌DUOLAC的制程：乳酸菌酦酵、收成?第一层蛋白质包埋?第二层包埋? 冷冻干燥 配 制 0.03％k-卡拉 胶 ,0.25％刺槐豆胶 ,灭菌后待用； 用无菌水配制乳酸菌菌悬液 。 第一层包埋: 将乳酸菌菌悬液加入到牛奶中 ,搅拌均匀 ,将混合液用小号注射器滴人到 PH=4 的酸溶液中，静置 10分钟,收集小颗粒 ,用 PH=4的无菌水洗涤数次 。
第二层包埋：0.03％k-卡拉胶和0.25％ 刺槐豆胶充分混合后 ,将上述收集的颗粒投人混合液 ,搅拌均匀 ,用大号注射器滴人到10℃ 冷水中 ,得到小颗粒 ,将小颗粒用10℃ 无菌水洗涤数次 ,滤干后放-18℃冷柜中冷冻 ,备用 。
2.2-2 在4个250ml 沙的锥形瓶 中各放200ml的人工胃酸溶液(PH=2.1) ,标记为A、B、C、D,往A 杯 投 入 双 层 包 埋 的 嗜 酸 乳 杆 菌 L-acidophilus；B杯 双 层 包 埋 的 干 酪 乳 杆 菌 L.casei；C杯D杯 分 别 投 入 未 包 埋 嗜 酸 乳 L.acidophilus、
干酪乳杆菌 L.casei。定时测活菌数 ,具体方法: 取一定量溶液进行样品稀释 ,培养基浇注菌液后在 36℃士1℃ 的培养箱培养 72h士3h ,用稀释平板菌落计数法计算菌落(cfu/ml),算出存活率 。 2.2-3 双层包埋的乳酸菌与未包埋的乳酸菌在室温下储存一年 ,定月测定乳酸菌活菌数 。 2.2-4 制造恶劣的后加工程序环境 ,进行加热试验 ,定时测定双层包埋乳酸菌经过后加工程序环境后的存活率 。
2.2-5 双层包埋乳酸菌稳定性试验
蛋白质与一些特定载体结合后, 溶解度会随水溶液的 pH 质改变, 例如玉米蛋白或奶蛋白在pH 4 时溶解度极低, 会在水中沉淀, 但是 pH 质调整到中性时, 蛋白质却会在水中溶解。DUOLAC 外层的蛋白质及特殊胶体都具有这样的特性, 在酸性环境中不会溶解, 保护乳酸菌安全通过胃部, 不受胃酸及胆盐的破坏 （参见图4和图1）。相对来说, 一般未经包埋处理的乳酸菌不耐酸,在胃里大约30 min后就会死亡。 同时,蛋白质层在小肠中一方面缓冲胆汁及胆酸对菌体未复活前可能的伤害,一方面协助乳酸菌黏附在肠壁绒毛上,同时提供菌体复活时立即可以使用的营养, 借此繁殖增加数量。所以其功能除了控制释放活菌速度外, 还兼顾提供营养, 而且此等包覆层能有效隔离乳酸菌与外界直接接触,对温度以及空气中水分较不敏感,因此活菌浓度可以维持又高又久。
DUOLAC的稳定度加速试验结果（图2），在40℃、湿度70%的加速试验环境中，35d后，DULAC乳酸菌活菌数只降低1~2个对数，但一般未经包埋的乳酸菌，却至少损失3~4个对数以上，存活率极低。
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图1 DUOLAC耐胆盐度（in 0.5％ Oxgall Solution）
图2 DUOLAC活性稳定加速试验（40℃，温度70％）
由于有双层保护，除了上述耐久存、耐酸等特性外，DUOLAC乳酸菌还有优越的热稳定性，详见表1，可以忍受更严苛的后加工程序，应用范围更加广泛，以打锭为例，高温高压(3.1-3.5Kg/cm2)再加工过程中DUOLAC乳酸菌打锭后存活率仍可维持50%以上。因此可说是目前市面上保持益生菌活性效果最好的技术获得多项世界专利。 tu
2.2-6 双层包埋乳酸菌的热稳定性试验
由于有双层保护, 除了上述耐久存、 耐酸等特性外, DUOLAC 乳酸菌还有优越的热稳定性, 以嗜酸乳杆菌和长双岐乳杆菌为例, 在不同温度和时间条件下其菌种的存活率见表 1。表 1 DUOLAC 热稳定度从表 1 可以看出, 双层包埋乳酸菌可以忍受更严苛的后加工程序, 而且仍具有一定的存活率,这让乳酸菌有了更广泛的应用范围。 表1 DUOLAC热稳定度
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温度/时间 嗜酸乳杆菌 存活率 长双岐乳杆菌 存活率 （分） ( cfu/g) (%) (cfu/g) (%) 50/00 100x10(9) 100 100x10(9) 100 50/20 60x10(9) 60 30x10(9) 30 50/60 57x10(9) 57 15x10(9) 15 60/20 42x10(9) 42 20x10(9) 20 60/60 32x10(9) 32 15x10(9) 15
3 结果与讨论
3.1 双层包埋后的乳酸菌溶解度随PH值变化情况
用牛奶蛋白/k -卡拉胶和刺槐豆胶作为包埋剂,k-卡拉胶和刺槐豆胶协同作用 ,形成网状结构的弹性凝胶 ,牛奶蛋白与外层胶体接触后 ,与其中的 k-卡拉胶形成触变凝胶 ,蛋白质与外层胶体结合后 ,溶解度随溶液PH而改变 ,在高酸溶液中凝聚沉淀 ,在中性溶液中溶解。试验结果表明 ,双层包埋的乳酸菌在PH=4的酸性溶液中 ,包埋材料产生聚集现象 ,当 PH逐渐上升到7 时 ,牛奶蛋白层逐渐剥离 ,释放出包埋层内的乳酸菌（图3）.
图3 双层包埋乳酸菌随PH值变化产生的凝集及分散现象
3.2 胃酸对双层包埋乳酸菌和未包埋乳酸菌活性的影响
经双层包埋剂处理的嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌在胃液达两 2h,仍有 87%和 90%的存活率（图4） ,不受胃酸破坏 ,而未经包埋处理的乳酸菌不耐酸 ,在胃里大约 30min后就死亡殆尽。
图4双层包埋乳酸菌在人工胃液溶液（PH=2.1）中的存活率
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