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及15℃、一小时之内，完全连接一微克l-DNA的HindIII片段所需的酶量。一般情况下，1ml（1U）的连接酶已经足够，而连接反应总体积则在10-15ml范围内。
影响连接反应的因素很多，包括温度、离子浓度、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。如果待连接的DNA片段携带由限制性核酸内切酶产生的粘性末端，则在较低的温度下，粘性末端退火形成含有两个交叉缺口的互补双链结构。这时的连接可视为分子内反应，其连接反应速度比分子间的连接速度快，因此理论上来说，连接反应温度应以不高于粘性末端的熔点温度（Tm）为宜。虽然Tm值随着粘性末端的长度及碱基成份而变化，但是大多数限制性核酸内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下。另一方面，T4-DNA连接酶连接活性本身的最适温度却是37℃，5℃以下活性大为减少，因此在实际操作时，连接反应温度与时间常采用下列几种组合：15℃-2小时、12℃-8小时、7℃过夜。
三、重组率及其影响因素
重组率是指在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比，虽然它与连接反应效率有关，但含义不同。如果外源DNA片段与载体DNA均用同一种限制性核酸内切酶切开，则连接反应产物可存在多种形式，如含有外源DNA片段的重组分子和自我连接的载体分子，后者称为载体的自我环化或空载。连接效率高并不一定等于重组率就高，在连接反应中增加连接酶的用量和延长反应时间，一般只能提高连接效率，但未必对重组率的提高有利。
提高重组率可采用下列方法：（1）提高外源DNA片段与载体DNA的分子数之比，理想的比例范围为二比一至十比一，这样可以增加外源DNA片段与载体分子之间的碰撞机会，减少载体DNA分子之间以及载体DNA两个末端之间的接触，从而降低载体自我环化的能力；（2）在连接反应前，先用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除其5’末端的磷酸基团，这样即使载体DNA分子的两个粘性末端发生退火互补，也不能形成共价环化结构，而且这种退火互补与重新开环是可逆进行的，这就为载体分子最大限度地接纳外源DNA片段提供了条件，而外源DNA片段与载体DNA退火后，连接酶仍可借助于外源DNA片段5’端的磷酸基团将两者连接在一起，形成在每一条链上各含有一个缺口的准重组分子，两个缺口之间的距离等于外源DNA片段的大小。除非外源DNA片段极小（＜50bp），一般情况下这种准重组分子在室温下不会开环。在后续的转化中，准重组分子同样可以进入受体细胞（转化效率稍低），并在受体细胞内得到修复，形成完整的重组DNA分子；（3）在连接反应前，用TdT酶在载体分子的3’羟基末端聚合一段同种碱基的寡聚核苷酸，防止载体DNA分子之间以及两个末端之间的连接，而在外源DNA片段的3’末端加上互补性的寡聚核苷酸，两者退火后甚至不经连接就可导入受体细胞内。
四、DNA分子重组/连接的方法 1．相同粘性末端的连接
如果外源DNA和载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解，两种DNA分子均含有相同的末端（经双酶切后，两种DNA的两个末端序列不同），因此混合后它们能顺利连接为一个重组DNA分子。经单酶处理的外源DNA片段在重组分子中可能存在正反两种方向，而经两种非同尾酶处理的外源DNA片段只有一种方向与载体DNA重组。这两种重组分子均可用相应的限制性核酸内切酶重新切出外源DNA片段和载体DNA，克隆的外源DNA片段可以原样回收。
用两种同尾酶分别切割外源DNA片段和载体DNA，由于产生的粘性末端相同，因此也可方便地连接。一种极端的例子是外源DNA用同尾酶A和B水解，而载体用这组同尾酶另外两个成员C和D酶切，则两种DNA分子的四个末端均相同，它们都属于最为简单的相同粘性末端的连接。值得注意的是，多
数同尾酶产生的粘性末端一经连接，重组分子便不能用任何一种同尾酶在相同的位点切开。例如，BamHI（识别序列为5’GGATCC3’）水解的DNA片段与BglII（识别序列为5’AGATCT3’）切开的片段连接后，所形成的重组分子在两个原切点处均不能为BamHI和BglII切割，这种现象称为酶切口的“焊死”作用。只有在少数情况下，由两种同尾酶产生的粘性末端经连接后可被其中一种酶切开。例如，EaeI的识别序列为5’PyGGCCPu3’，EayI的识别序列为5’CGGCCG3’，它们形成的粘性末端相同，连接后的重组分子序列5’PyGGCCG3’仅能为EaeI所识别，显然这种情况依赖于限制性内切酶识别序列的相对专一性。
2．平头末端的连接
T4-DNA连接酶既可催化DNA粘性末端的连接，也能催化DNA平头末端的连接，前者在退火条件下属于分子内的作用，而后者则为分子间的反应。从分子反应动力学的角度讲，后者反应更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平头末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平头末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平头末端的连接速度比粘性末端慢10-100倍。为了提高平头末端的连接速度，可采取以下措施：（1）增加连接酶用量，通常使用粘性末端连接用量的十倍，但在实际操作中，这种方法并不多用；（2）增加DNA平头末端的浓度，提高平头末端之间的碰撞机率；（3）加入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平头末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞机率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20-25℃较为适宜。
连接体系中高浓度的ATP对平头末端的连接极为不利。ATP浓度超过1mM，会发生腺嘌呤核苷酸在连接位点的随机插入；当ATP浓度升至2.5mM时，又会显著地抑制平头末端连接反应本身。因此，除非需要特异性抑制平头末端的连接，对大多数连接反应而言，0.5mM的ATP浓度是较为合适的。
3．不同粘性末端的连接
不同的粘性末端原则上无法直接连接，但可将它们转化为平头末端后再进行连接，所产生的重组分子往往会增加或减少几个碱基对，并且破坏了原来的酶切位点，使重组的外源DNA片段无法回收；若连接位点位于基因编码区内，则会破坏阅读框架，使之不能正确表达。不同粘性末端的连接有四种类型：
（1）待连接的两种DNA分子都具有5’突出末端。在连接反应之前，两种DNA片段或用Klenow酶补平，或用S1核酸酶切平，然后进行连接。前者产生的重组分子多出四对碱基，而后者产生的重组分子则少去四对碱基。一般情况下大多使用Klenow酶补平的方法，因为S1核酸酶掌握不好，容易造成双链DNA的降解反应；
（2）待连接的两种DNA分子都具有3’突出末端。Klenow酶对这种结构没有活性，可以用T4-DNA聚合酶将这两种DNA的3’末端切除，形成平头末端后再连接，所产生的重组分子同样少了四对碱基；
（3）一种DNA分子具有3’突出末端，另一种DNA分子携带5’突出末端。这种情况要求两种DNA分子在连接前，分别进行相应的处理，若5’突出末端用Klenow酶补平，而3’突出末端用T4-DNA聚合酶修平，则连接产生的重组DNA分子并没有改变碱基对的数目；
（4）两种DNA分子均含有不同的两个粘性末端。通常先用Klenow酶补平一种DNA分子的5’突出末端，再用T4-DNA聚合酶切平3’突出的另一末端，而且两种DNA分子可以混合一同处理。
在有些情况下，含有不同5’突出粘性末端的两种DNA分子经Klenow酶补平连接后，形成的重组分子可恢复一个或两个原来的限制性内切酶识别序列，甚至还可能产生新的酶切位点，如XbaI与HindIII的粘性末端（XbaI切点恢复）、XbaI与EcoRI（两者切点均保留）以及BamHI与BglII（产生ClaI位点）。
4．人工粘性末端的连接
上述不同粘性末端的连接大都破坏了原来的限制性内切酶识别序列，导致重组的外源DNA片段不能回收。为了克服这一困难，可以用TdT处理经酶切的DNA片段，使之在3’末端增补核苷酸同聚物，然后进行连接，同时由TdT酶产生的人工粘性末端还可有效地避免载体分子内或分子间以及外源DNA片段之间的连接，以提高重组率。
（1）5’突出的末端。若外源DNA片段含有EcoRI的粘性末端，则先用Klenow酶补平，然后用TdT酶加上多聚腺嘌呤核苷酸的人工粘性末端，使得EcoRI酶切口在连接后完好保留；载体DNA分子则在补平后加上多聚鸟嘌呤核苷酸的互补人工粘性末端，两种分子退火粘在一起。由于TdT酶并不能精确控制多聚核苷酸末端的碱基数目，因此在同一DNA分子的两个人工粘性末端以及两个分子之间的人工粘性末端有可能长度不等，但若此时再用Klenow酶填补缺刻，经连接后就能形成完整的重组分子，而克隆的外源DNA片段仍可用EcoRI回收。
（2）3’突出的末端。若外源DNA片段带有PstI的粘性末端，则用TdT酶直接加上多聚鸟嘌呤核苷酸的人工粘性末端（目的是保留PstI的酶切位点），而载体分子则加上多聚胞嘧啶核苷酸的互补末端，退火后用Klenow酶填补有可能出现的缺刻，并将之连接成重组分子，此时克隆的外源DNA片段可用PstI回收。
（3）平头末端。DNA分子的平头末端不管是否由限制性内切酶产生，经TdT酶接上同聚物人工粘性末端后，一般情况下不能用限制性内切酶回收插入片段，但可用S1核酸酶从重组分子上切下这个插入片段。其做法是：两种DNA分子分别用TdT酶增补多聚腺嘌呤核苷酸和多聚胸腺嘧啶核苷酸的人工粘性末端，退火后用Klenow酶填补缺刻，并将之连接成重组分子。此时或克隆后只需将重组分子稍稍加热，AT配对区域就会出现单链结构，用S1核酸酶处理即可回收插入片段，而重组分子的其它区域一般不会出现大面积连续的AT区域，因此其Tm总是高于AT人工粘性末端（通常由30-50个AT碱基对组成）区域的Tm，只要掌握合适的加热温度，就能保证S1核酸酶作用位点的正确性。
五、酶切位点的定点更换
在有些分子克隆实验中，需要将DNA上的一种限制性内切酶识别序列转化成另一种酶的识别序列，以便DNA分子的重组。有两种方法可以达到这个目的。
（1）加装人工接头。接头是一段含有某种限制性内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体和十聚体。图3-23表示的是一种利用人工接头片段在DNA上更换或增添限制性内切酶识别序列的标准程序。如果DNA分子的两端是平头末端，则将人工接头（Linker）直接连接上去，然后用相应的限制性内切酶切出粘性末端。若要在DNA分子的某一限制性内切酶的识别序列处接上另一种酶的人工接头，可先用前一种酶把DNA切开，然后依照5’突出末端用Klenow酶补平以及3’突出末端用T4-DNA聚合酶切平的原则，处理DNA末端使之成为平头，再接上相应的人工接头。
（2）改造识别序列。这种方法的原理是利用一种限制性内切酶的识别序列改造另一种酶的识别序列，从而使前者迁移到后者的位置上。例如，将DNA上的AluI识别序列改造成EcoRI识别序列，其操
作程序可由图3-24表示：先用AluI切开DNA片段，将任何一段含有EcoRI识别位点的DNA片段用EcoRI切开，并以Klenow酶补平粘性末端，两种DNA分子连接，再用EcoRI切开重组分子，原来的AluI位点即转化为EcoRI位点。这里应区分两种情况：第一，DNA片段上有多个AluI位点需要同时换成EcoRI识别位点；第二，DNA分子上只有一个AluI位点，两种情况的操作方式并不完全相同。由上述操作程序可知，任何能提供3’G的限制性内切酶识别序列，包括其粘性末端经Klenow酶补平或经T4-DNA聚合酶切平，均可转变为EcoRI识别序列以及与EcoRI相似的其它酶的识别序列，如：AvaII、BamHI、BstEII等。根据同样的原理，还可将提供3’C、3’A和3’T的限制性内切酶识别序列更换成相应的其它酶识别序列，这些序列的对应关系列在表3-9。
第三节 重组体导入细菌细胞
（重组DNA分子的转与增）
DNA重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化（Transformation）。对于不同的受体细胞，往往采取不同的转化战略，
一、重组DNA分子的转化操作
DNA重组技术中的转化仅仅是一个将DNA重组分子人工导入受体细胞的单元操作过程，它沿用了自然界细菌转化的概念，但无论在原理还是在方式上均与细菌自然转化有所不同，同时也与哺乳动物正常细胞突变为癌细胞的细胞转化概念有着本质的区别。重组DNA人工导入受体细胞有许多方法，包括转化、转染、接合以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在DNA重组技术中统称为转化操作。
经典的细菌转化现象是1928年英国的细菌学家Griffich在肺炎双球菌中发现的，并在1944年由美国的Avery形成完整的转化概念。细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状，其中来自供体菌的游离DNA片段称为转化因子。在自然条件下，转化因子由供体菌的裂解产生，其全基因组断裂为100Kb左右的DNA片段。具有转化能力的DNA片段常常是双链DNA分子，单链DNA分子很难甚至根本不能转化受体菌。就受体细菌而言，只有当其处于感受态（即受体细胞最易接受外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态）时才能有效地接受转化因子。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往往受自身的遗传特性、菌龄、生理培养条件等诸多因素的影响。
细菌转化的全过程包括五个步骤：（1）感受态的形成。典型的革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚，形成感受态时细胞表面发生明显的变化，出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等；（2）转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合，单链DNA或RNA、双链RNA以及DNA-RNA杂合双链都不能结合在膜上；（3）转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中，这个吸收过程为EDTA所抑制，可能是因为核酸酶活性需要二价阳离子的存在；（4）整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处；（5）转化因子单