发布时间 : 星期一 文章第39章 基因工程及蛋白质工程 - 图文更新完毕开始阅读
3．? 噬菌体 ? 噬菌体的基因组是长度约为50kb 的线性双莲DNA 分子。在其两端，各有一条由12 个核苷酸组成的互补粘性末端。当? 噬菌体DNA 进入寄主细胞后，线性DNA 分子通过粘性末端的碱基配对而结合，形成环状DNA 分子。这种由粘性末端结合形成的双链区段为cos 位点。
现用的? 噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：插入型载体，具有一个可供外源DNA 插入的克隆位点，如?gt10、?gt11；替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的?DNA 区段可被外源插入的DNA 片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型载体只能插入较小的外源DNA 片段，而替换型载体能插入较大的外源DNA 片段（20-24kb 左右）。当重组体DNA分子大于? 噬菌体基因组105%或小于75%时，重组噬菌体的活力会大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重组体DNA 分子长度应控制在包装限度范围内。 ? 噬菌体重组体分子不具有抗生素抗性选择标记，主要是依据噬菌斑的形态学特征和Xgal-IPTG 显色反应来筛选重组子。cI 基因的存在将使λ噬菌体进入溶源状态，因此在培养基上形成的是混浊型的噬菌斑。cI 基因失活或缺失的λ噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑。根据这个形态学特征可筛选λ重组体分子。 许多? 载体，如charon2、?gt11 含有编码a 半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位点）。由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG 和Xgal 的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑。当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就会在Xgal-IPTG 培养基上形成无色噬菌斑，如果在替换型载体的可替换区段含有lacZ 基因序列，也会出现同样结果。
4．Cosmid 质粒
黏粒载体本身长4-6kb，具有质粒和? 噬菌体两种载体的性质，能像质粒一样复制及转化细菌，在细菌中其增殖与质粒复制一样，产生的重组子是菌落而不是噬菌斑，同时也具有? 噬菌体的cos 位点，能与? 噬菌体一样在体外被包装成病毒颗粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因组文库要比在? 噬菌体中困难得多，只有在靶基因过大，不能作为单个DNA 区段在? 噬菌体载体中克隆增殖，或者要分离一系列跨过染色体DNA 特大区段的重叠克隆时，才使用黏粒载体。
用于克隆大片段DNA 的 Cosmid 质粒：
5．酵母人工染色体
定向克隆：两个粘性末端的序列不同，仅按照一个方向插入质粒。