发布时间 : 星期日 文章分子生物学技术实验指导2009版更新完毕开始阅读
⑨ 生理盐水(0.9%氯化钠溶液)
⑩ 白细胞稀释液:100ml 1%冰醋酸中加10g/L美蓝3滴。 2、 总RNA提取
① DEPC处理水氯仿(分析纯) ② 异丙醇(分析纯) ③ 70%乙醇
④ 异硫氰酸胍变性液 3、 逆转录-聚合酶链反应
a) AMV逆转录酶 b) RNasin(20-40U/ul) c) 随机引物
d) 脱氧核苷三磷酸(dNTP) e) 逆转录缓冲液(5×) f)
Taq DNA聚合酶
g) TNF-α引物 h) PCR缓冲液(10×) i)
MgCl2(25mmol/L)
4、 酶联夹心杂交
a) 亲和素-辣根过氧化物酶结合物 b) 20×SSC c) 包被液 d) 封闭液 e) 2×杂交液 f)
洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ
g) 终止液
[实验步骤]
1、人外周血单个核细胞的分离
① 用塑料吸管吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管。
② 取抗凝血1ml,用1ml生理盐水稀释混匀后,用塑料吸管吸取稀释抗凝血沿管壁
缓慢加于淋巴细胞分离液上面(每人2管)。
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③ 将试管置离心机中,室温,2000rpm,20min。
④ 用塑料吸管吸去最上层的血浆,再吸取单个核细胞层,加生理盐水至离管口1cm,
混匀后离心,2000rpm,5min。
⑤ 去上清液,再次加生理盐水0.5ml ,转入1个Eppendorf管中,2000rpm,5min。 ⑥ 留细胞沉淀于Eppendorf管用于下一步的总RNA提取。 2、单个核细胞中总RNA抽提纯化:异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法
① 在留有细胞沉淀的Eppendorf管中依次加入500μL变性液、100μL氯仿/异戊醇
(49/1),置旋涡混合器上混匀,冰浴15min。
② 4℃12000rpm,离心15min。吸取上层水相转入Eppendorf管中,加等体积异丙醇,
-20℃,0.5h。
③ 4℃12000rpm,离心15min,倾去上层异丙醇,加入500μL 70%乙醇进行洗涤。
4℃12000rpm,10min,倒去70%乙醇,留沉淀真空烘干。 ④ 用10μL DEPC处理水溶解RNA,-20℃保存,备逆转录之用。 3、逆转录
① 按下列组成调制反应液:
样品总RNA 5μL AMV逆转录酶 20u 随机引物 100pmol 脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各10mmol/L) 2.0μL 逆转录缓冲液(5×) 4μL RNasin(20-40U/ul) 0.5μL DEPC处理水 补至20μL
阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板,其余成份相同。将上述反应成份加于0.5ml Eppendorf管,混匀,简短离心。
② 42℃60min。90℃变性5分钟。逆转录产物于4℃保存。 4、PCR扩增
① 按下列组成调制反应液:
cDNA模板 5μL TNF-α引物(25umol/L) 2.0μL 脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各2.5mmol/L) 4.0μL
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PCR缓冲液(10×) 5.0μL MgCl2(25mmol/L) 3.0μL 蒸馏的去离子水 补至49μL
以逆转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照,将上述反应成份加于0.5ml Eppendorf管,混匀,短暂离心,加入30μL石蜡油。
② 扩增: 94℃5min,然后按以下条件进行热循环:94℃45s,56℃30s,72℃30s,循环30次。最后72℃延伸5分钟。
5、酶联夹心杂交检测FGF-αRT-PCR产物
① 用包被液稀释捕获探针,终浓度为500nmol/L,100μL /孔加入到DNA结合微孔板
上,封孔后37℃,1小时。
② 室温下洗液Ⅰ洗3次,洗去未结合的捕获探针。 ③ 加入200μL /孔封闭液, 37℃,30min后弃去。
④ PCR产物变性:取5μL PCR产物用双蒸水作10倍稀释,100℃水浴10min后立即
置冰浴。
⑤ 在DNA结合微孔板内加入49μL稀释的变性PCR产物,50μL 2×杂交液,1μL检
测探针(50μmol/L),混匀后置48℃水浴箱,120 min。
⑥ 弃液后,用48℃预温的洗液Ⅱ洗3次,每次48℃,5min,弃液,拍干。 ⑦ 加入封闭液200μL /孔,37℃,15min后弃去。
⑧ 用封闭液1:1000稀释亲和素-辣根过氧化物酶结合物,100μL /孔加入到微孔板内,
室温,30min。
⑨ 用37℃预温的洗液Ⅲ洗3次,每次37℃, 3min,拍干。
⑩ 加入底物A、B各50μL,混匀后置于暗处显色20min。加入终止液50μL,混匀后
于酶标仪上读取450nm吸光度值。
[注意事项]
1. Eppendorf管(0.5ml)及tip头等需高压灭菌并一次性使用。
2. 用塑料吸管吸取稀释抗凝血加于淋巴细胞分离液上面动作要轻缓,稀释抗凝血与淋巴细胞分离液的体积大致相等。
3. 离心后试管内液面可分为五层,从上到下依次为血浆、单个核细胞、淋巴细胞分离液、粒细胞、红细胞。单个核细胞层为云雾状的白膜。
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4. 抽提总RNA时应小心吸取上层水相转入Eppendorf管,注意勿吸取水相与有机相的界面层,此层含有DNA及蛋白质,这些物质对PCR扩增有影响。
5. 室温低于20℃时,洗液Ⅱ中的SDS易结晶析出,使用前需用温浴使之溶解。 PCR产物过多时,宜将PCR作更大倍数的稀释,变性后再做酶联夹心杂交。
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