发布时间 : 星期五 文章分子生物学技术实验指导2009版更新完毕开始阅读
Eppendorf管中。
11、加等体积氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新Eppendorf
管中。
12、加0.6倍体积异丙醇，置冰浴3 0 min ，12000rpm离心10分钟, 弃上清。 13、沉淀用70%乙醇0.5 ml洗一次,弃上清，室温放置10分钟，挥干乙醇。
14、用30 μl TE溶解沉淀的DNA，置4℃保存，（不要吹打，放置10分钟后自然溶解）。
质粒示意图：
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实验二 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
[原理]
琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的最常用的方法。不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离从100bp至60kb的DNA片段。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，迁移速率越慢；而且还与DNA分子构型有关，对于分子量相同而构型不同的DNA分子来说，迁移速率为负超螺旋构型分子>线状构型分子>开环状构型分子。
质粒DNA在电泳体系中带负电向正极移动，由于质粒DNA有三种存在形式，（1）共价闭环DNA（covalently closed circμlar DNA，ccc DNA），常以负超螺旋构型存在；（2）开环DNA（open circμlar DNA，oc DNA），质粒DNA双链中有一条链发生一处或多处断裂形成缺口，可以自由旋转从而消除了张力，形成松驰的环状分子；（3）线状DNA（linear DNA），质粒DNA的两条链在同一处断裂而形成线状分子；因此，在电泳时，同一质粒的不同构型有不同的迁移速率，从而得到分离，从阳极至阴极分别为共价闭环DNA、线状DNA和开环DNA。
由于低浓度的荧光染料溴化乙锭(ethidum bromide，EB)会嵌入到DNA分子的碱基对中形成荧光复合物，在紫外线激发下发射荧光，其强度与DNA的含量成正比（肉眼观察可检出0.05-0.1 ug的DNA）。
因此，DNA在含有EB的琼脂糖凝胶中电泳结束后，可在紫外灯下观察质粒DNA在凝胶中的位置和含量。 [器材]
1、稳压稳流电泳仪 2、小平板电泳槽 3、紫外检测仪
4、照相机（带快门线及黄色滤光片） 5、黑白胶卷 6、微量进样器 7、移液器及吸嘴 8、胶带
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9、Eppendorf管 10、眼科镊子 11、手术 [试剂]
1、TAE缓冲液
（1）贮存液：50×TAE：每升溶液中含242克Tris，57.1毫升冰乙酸，100毫升0.5mol/L
EDTA(pH 8.0)。 （2）工作液：1×TAE
2、10×上样缓冲液：0.25%溴酚兰—40%（W/V）蔗糖水溶液。
3、1.0%琼脂糖：称1.0克琼脂糖，加100毫升1×TAE缓冲液，加热溶解。
4、10mg/ml溴化乙锭贮存液：1克溴化乙锭（溴化乙锭为核酸的荧光染色剂，有强烈的诱变性和中度毒性，使用时需戴手套）用100毫升重蒸水溶解，避光保存。
[实验步骤]
1、准备小平板电泳槽，取出平板，用胶带封口，放回槽内，并插上样孔梳，调节上样孔梳，使上样孔梳底部与凝胶模底板的距离为0.5-1.0mm。
2、将用1×TAE缓冲液配制的1.0 % 琼脂糖凝胶置微波炉或沸水浴加热使之熔化，冷却至60℃后加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5ug/ml，混匀。
3、将琼脂糖凝胶趁热倒入平板达3—5毫米厚，静止40分钟让其完全凝固。
4、去掉平板两端的封口胶带，将凝胶随凝胶模一起放入加有足量的1×TAE缓冲液电泳槽中（缓冲液浸没过凝胶面2—3毫米），小心拔出样孔梳。
5、取5μl质粒DNA，加入1 μl 6×上样缓冲液，混合后用微量进样器小心加入样品孔。 6、以靠近上样端接负极，另一端接正极，接通电源，以5v/cm（该距离为电泳槽两电极间的距离，非凝胶自身的长度）的电压电泳30—60分钟。
7、电泳结束后，带上保护手套，倾去电极缓冲液，取出凝胶置透明薄膜上，在紫外灯下观察电泳结果，并照相（光圈5.6、B门暴光2-5分钟）记录结果。
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附表：
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
琼脂糖含量 线性DNA分子的有效分离范围 [% （W/V）] （KB）
0.3 5 - 60
1 - 20 0.8 - 10
0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 3 2.0 0.1 - 2
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