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分子生物学实验指导
2009年9月19日修订
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实验一 质粒DNA的制备
[原理]
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中，大小在1—200kb之间，它们为双链闭环状的DNA分子。质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达其携带的遗传信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，离开宿主细胞就不能存活，而寄主在没有质粒存在时是可以正常生长的。质粒可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，其控制的许多生物学功能通常是对宿主细胞的补充。因此，可以认为质粒是一种寄生性的自主复制子。
质粒在细胞内的复制一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松驰控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，因此，染色体不复制时，其也不复制；后者在整个细胞周期中随时都可以复制；通常，前者在细胞内只含1个或几个质粒分子，而后者在细胞里有许多拷贝，一般在20个以上，甚至多达数千个。
在基因工程中，通常使用的是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而人工构建的质粒，称为质粒载体，其带有一个或多个选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有若干个限制性核酸内切酶识别的位点（多克隆位点）。由于去掉了天然质粒中的大部分序列，一般不含转移所必需的基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的转移。常用的质粒载体有PUC18/19、PBR322、PGEM—32、PKK223—2等，其大小一般为2—5kb，由于其分子小，因此便于操作。
分离纯化质粒DNA主要是利用宿主染色体与质粒之间的差异来进行的，如染色体DNA分子量比质粒DNA大得多，又如染色体DNA在提取过程中大多断裂成线状分子而质粒
DNA为共价闭合环状结构。 分离纯化质粒
DNA包括三个基本过程：
1、培养细菌使质粒大量扩增；
2、收集和裂解细菌，并去掉蛋白质和染色质DNA； 3、分离纯化质粒DNA。 目前质粒 碱裂解法
将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中，经EDTA处理，可破坏细菌细胞壁和细胞外膜，阴
DNA制备大致有三种，1、碱裂解法，2、煮沸法，3、去污剂裂解法。
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离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）或Triton x-100处理使细胞崩解，经碱处理可使氢键断裂、破坏碱基配对，使细菌线状染色体DNA和质粒DNA变性，加入乙酸钾后质粒DNA迅速复性为可溶性质粒DNA，小分子RNA也呈可溶状态，而变性的染色体DNA、高分子RNA以及K+/SDS/细胞膜复合物缠绕附着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心去除，而质粒DNA及细菌中的可溶性蛋白质、核糖核蛋白体和tRNA等留在上清中。通过加入蛋白水解酶和核糖核酸酶可以分解之。通过碱性酚（pH8.0）或酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)或氯仿-异戊醇等有机溶剂除去蛋白质、氯化锂沉淀RNA和残存的蛋白质、再用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即得纯化的质粒DNA。 [器材]
1、台式高速离心机 2、涡旋器
3、摇床（干热振荡培养箱） 4、手提式高压消毒锅 5、微量进样器 6、移液器
7、1.5ml Eppendorf管 8、100ml三角烧瓶 9、水浴锅 [试剂]
1、 LB( Luria—Bertani)培养基: 950ml去离子水中加入胰蛋白胨10克、酵母提取液5克、
NaCl 10克，摇荡至溶解，用5N NaOH（约1.6 ml）调pH至7.5，用去离子水定容至1000ml，15磅/英寸2高压灭菌20分钟（LB培养基不能反复高压）。
2、 氨苄青霉素（Ampicillin , Amp）母液：10 mg/ml水溶液,-20℃冰箱贮存，备用。 3、 LB-AMP液体培养基: 在100 ml LB培养基中加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5
ml。
4、 LB固体培养基：在LB培养基中加1.4%琼脂粉，经高压灭菌制备LB固体培养基。 5、 LB-AMP固体培养基（含氨苄青霉素50ug/ml）：在100 ml LB培养基中加1.4g琼脂
粉，经高压灭菌后冷却至55℃,加入氨苄青霉素（10 mg/ml）母液0.5 ml ,制备LB-AMP固体培养基。
6、 1 mol/L Tri-HCl Buffer ：800 ml水中加Tris 121.1 g 、浓HCl( pH 8.0时42ml、pH 7.6
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时60ml、pH 7.0时70 ml)，用水定容至1L。
7、 1 mol/L EDTA: 800 ml水中加 EDTA-Na2-2H2O 372.2 g 、NaOH 约20g ，调pH至
8.0 ，用水定容至1L，高压。
8、 GTE缓冲液[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl(PH8.0),10mmol/L EDTA]：高压灭
菌15分钟，贮存于4℃冰箱备用。注意：GTE缓冲液不可反复灭菌。
9、 TE缓冲液[ 10 mmol/L Tris·Cl (PH8.0), l mmol/L EDTA ]：每100ml 蒸馏水加１.
０ml 1 mol/L Tris·Cl(pH8.0), 200 μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。 10、
3mol/L乙酸钾溶液：29.5ml冰乙酸加KOH颗粒调至pH4.8，加双蒸馏水定容
至100ml。不必高压灭菌，室温下贮存。 11、 12、 13、 14、 15、 16、
无水乙醇和70%乙醇。 10% SDS
异丙醇 Tris饱和酚 氯仿
NaOH—SDS溶液：10mol/L NaOH 20 μl, 加双蒸馏水880μl， 10% SDS 100μl ,
新鲜配制。 17、 [实验步骤]
1、将含有PUC-tem质粒的菌种接种于LB-AMP固体培养基上，37℃培养过夜。 2、挑取菌落接种到5ml LB-AMP液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长期备用。 3、取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒钟收集菌体。
4、弃上清，将Eppendorf管倒置在吸水纸上，吸干溶液。
5、加100μl GTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。 6、加入200μl新鲜配制的NaOH—SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。 7、加入150μl预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。
8、 在4℃下于台式高速离心机12000 rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新Eppendorf 管中。
9、加入2μg/μl Rnase溶液 2 μl，37 ℃ 30 min。
10、加等体积酚、氯仿抽提一次，12000 rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新
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2μg/μl Rnase：用TE Buffer稀释。