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不同pH对猪精液常温保存效果分析
作为能量来源；而精子运动方式，则主要表现在精子鞭毛的摆动形式，及因此产生的精子直线或非直线运动，其独立的运动功能，依赖于正常的鞭毛结构与ATP的存在。对精子运动的检测和分析，其资料的精确性、丰富性和综合性，一方面取决于观察和研究的重点和需要，而更重要的一方面是取决于观察分析技术 的质量和准确。
1.3.2 精子顶体完整率
顶体在精子受精过程中起着重要的作用。因为它能够释放蛋白质分解酶消化卵
丘细胞之间的黏合基质，使精子能过通过卵的被膜进行受精。由于顶体结构的畸形，可导致受精率降低或者不受精。精子老化或损伤，会引起顶体帽破坏，先是顶体脊部变化。最后整个顶体消失，顶体完整率和不返情率之间比精子活率与不返情率之间相关性更强。因此，检查精子顶体完整率很重要。
精子穿过卵子透明带以前要发生顶体反应，掌握发生顶体反应时顶体结构变化，有助于我们进一步了解受精过程，从而找到提高受胎率的方法。但精子只有具备完整的顶体才能发生顶体反应，从而穿过透明带[14]。
顶体反应是精子获能后的必然结果，一般包括包裹精子头部的质膜、顶体外膜融合和破裂，释放内含物的过程。这一反应是精子与卵子融合必然经历的反应之一。精子获能的一般过程为：精子头部的质膜从赤道段的前部变得疏松，随后是质膜和顶体外膜发生融合，并形成许多泡状结构，最后由顶体膜和顶体基质释放出顶体酶系，主要是透明质酸酶和顶体素。根据精子顶体完整和损伤与否，可以将顶体形态分为4种类型：
1. 顶体完整型：精子头部外形正常，着色均匀，顶体完整，边缘整齐，可见微隆起的顶体嵴，赤道带清晰。
2. 顶体膨胀型：顶体轻微膨胀，边缘不整齐，顶体嵴肿胀，核前细胞不明显或缺失。
3. 顶体破损型：顶体破损，精子质膜严重膨胀破损，着色钱且不均匀，头前部边缘不整齐。
4. 顶体全脱型：精子顶体全部脱落，精子核裸露。
1.3.3精子质膜完整率
精子能够成功与卵子受精需要具备功能良好的质膜，精子质膜上含有丰富的多
聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分，精子的新陈代谢、活力的维持、获能、顶体反应以及精卵结合等都需要与精子质膜功能完整性密切相关[15]。因此，精子质膜功能可能是评估精液质量的重要指标，其检测技术的研究已受到越来越来多的重视。
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精子质膜组分对精子质量具有非常重要的作用，质膜功能良好更是精子发挥一些特定功能的必要前提。作为一种半渗透屏障，精子质膜维持和调节胞内成分，质膜破损会导致精子内环境失衡，最终精子死亡。现在发展了一下检测精子质膜功能的方法。
1.3.3.1 精子尾部低渗肿胀试验
精子在低渗溶液中，必须重新建立内外液之间的平衡，水分子通过质膜进入精子，使精子体积增大而膨胀，这是活精子质膜功能正常的标志。由于质膜的肿胀是精子尾部发生弯曲，这种变化在显微镜下很容易观察到，而质膜功能不全的精子表现为不膨胀。所以发生肿胀的精子数越多，证明精子质膜无损伤，精子功能良好[16]。这个试验简单、迅速，可作为体外精子质膜功能良好的指标，预测精子潜在的受精能力。
1.3.3.2 伊红Y水试验
显微镜直接观测法容易将缺乏活力的精子认为是死精子，伊红Y水试验利用伊红Y水染料能使死精子着色的原理来提高区分精子存活率的准确性。死亡的精子因质膜通透性改变可以使伊红Y染料透过精子质膜，精子质膜内带阳离子的物质可与带阴离子的酸性伊红Y染料结合被染成红色[17]。显微镜下观察活精子不着色，胞质透明，死精子着红色。伊红Y水试验除可检测精子尾部肿胀率来反映质膜功能外，还可以通过检测精子头部未着色率来评估精子头部质膜功能。
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试验研究
第二章 pH对猪精液常温保存效果研究
猪人工授精的成败在很大程度上取决于精液的质量。由于猪精子对低温比较敏感，冷冻保存精液的效果较差，因此在猪人工授精中主要使用常温保存精液。而常温保存稀释液的pH对于猪精液的影响比较大。为了提高人工授精的效果和普及人工授精技术，对于猪精液的常温保存提出了更高的要求。所以通过研究pH对于精液活率的影响和精子的生理活动来提高精液的常温保存技术，从而提高猪人工授精的效果。
本试验选取自配稀释液Modena和BTS，通过对比2种稀释液保存后精子的活力、有效保存时间、质膜完整率和顶体完整率，来分析精子在保存时间的生理活动以及用自配的不同的pH（5.75，6.00，6.25，6.50，6.75，7.00，7.25）稀释液进行常温保存，对精子的活力、畸形率，精子的有效存活时间，总存活时间进行分析。
2.1.材料与方法
2.1.1试验动物和采精时间
杨凌区养猪服务站，按常规饲养方法饲养管理，20月龄健康杜洛克、大约克和长白种公
猪各6头。
2.1.2采精方法
手握法采精。采精员首先洗净、消毒、擦干手掌，然后将手握成空拳，于公猪阴茎伸出
同时，导入空拳拳内，让其抽送转动片刻，再用手紧握阴茎龟头螺旋部分，随阴茎充分勃起时顺势牵伸向前，不让滑脱，有节奏的一紧一松的施加弹性刺激，直至引起公猪射精。公猪射精时，另一只手持带有过滤纱布的保温集精杯收集富含精子部分的精液，公猪射精停止，可按上述方法再次施加压力，即可引起公猪再次射精，直到公猪射精结束，自动从台畜上下来为止。试验期间控制采精频率，隔天进行一次。
2.1.3试验仪器
超纯水仪、电子分析天平、恒温加热板、显微镜、水浴锅、恒温箱、保温箱等。 2.1.4精液处理
采得的猪精液用四层脱脂纱布过滤，除去胶状物，同时检查原精的品质。
2.1.5精液品质检查方法 2.1.5.1精子活率
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按直线运动的精子数占视野中精子总数的百分率，具体操作步骤： （1）从保温箱中取出精液，缓慢摇匀，保证离心管中精液均匀没有沉淀。 （2）在显微镜上放置恒温板，保持37~38 ℃。
（3）在显微镜下观察10个不同视野，在每个视野中分别记录20个精子的运动状况，记录呈直线运动精子的数。
（4）计算直线前进运动精子的百分率，即精子活率： 精子活率=直线运动的精子数/总精子数×100 %
2.1.5.2精子存活时间
从精液稀释完成开始计算，到稀释精液活率下降到0.6的时间。
2.1.5.3精子顶体完整率
对精子进行顶体染色，在显微镜下观察顶体完整精子的比例。具体操作步骤：
（1）制片：将精液滴于载玻片一端，用另一个载玻片推片，要求薄而均匀，风干5 min。 （2）固定：用滴管吸固定液，使载玻片一端稍抬高，将固定液缓缓向下流，直到铺满整个载玻片，然后平放静止15 min后，将固定液弃去，用流水冲洗后，凉干。
（3）染色及观察：用姬姆萨液染色90 min后将染色液弃去，流水冲洗后待自然干燥，干后制成标本。完全干燥后直接用400倍显微镜观察，精子顶体呈紫色包围精子头前部，检查五个不同视野，观察200个精子中顶体异常数，计算出精子顶体完整率。
（4）计算：顶体异常率=顶体异常精子数/所计精子数×100 % 顶体完整率=1-顶体异常率
2.1.5.4精子质膜完整率
精子尾部低渗肿胀试验(hypo—osmotic swelling test，HOST)，在显微镜下观察肿胀弯尾的精子比例。具体操作步骤：
（1）配制低渗溶液：取用果糖1.351 g，二水柠檬酸钠0.735 g，加双蒸水定容至1 L，4 ℃保存备用。
（2）检测：取用稀释液稀释后的精液0.1 mL加入1 mL低渗液，37 ℃恒温水浴30 min，取一滴混合液于载玻片上，在400倍显微镜下观察200个精子，计算精子尾部出现膨胀的精子数占总精子数的比例。
（1）质膜完整率的计算：质膜完整率=弯尾精子数/全部精子数×100 %
2.1.6稀释剂配方
Modena与BTS的基础配方如下表1。
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