发布时间 : 星期二 文章双向电泳使用说明 - 图文更新完毕开始阅读
3.5 MutiphorⅡ和固相干胶条设备（Immobiline Dry Strip Kit）
3.5.1IPG胶条重新水化——固相干胶条膨化托盘（Immobiline Dray-strip Reswelling Tray）
固相干胶条膨化托盘具有12个独立的储液槽。每一条储液槽都能安装长达18㎝长的单条IPG胶条。分离式的储液槽能减少每条IPG胶条的重水化液体积。 (1)膨化托盘（图9）的准备
从托盘上完全移去保护盖，通过旋转调平脚使托盘水平，直至气泡位于灵敏水平器的中间，确保托盘的干净和干燥。
(2)加入重新水化液 根据表10所述，将适量的重水化液用吸管加入到各槽中。将溶液放入到槽中间，除去任何大的气泡。
注意：确保所有样品被吸收，不要加入过量的重水化液。
表10：每条IPG胶条的重水化液体积
IPG胶条长度（cm） 7 11 13 18 24
① 若加样时包含样品
每条胶的总体积(ul)① 125 200 250 340 450
（3）安放IPG胶条（图10）
从IPG胶条除去包装，放低胶条一端，并且使胶条成尖的一端靠着槽的倾斜的一端；降低另一端，使胶条靠近溶液。为了使胶条被溶液浸润，慢慢的抬高或放低胶条并且来回的沿着液体表面滑动。注意不要使IPG胶条底部产生气泡。
（4）在IPG胶条上铺上一层IPG覆盖夜（IPG Cover Fluid）用1.5-3ml 的IPG覆盖液，覆盖在每一条IPG胶条上，减少蒸发和尿素结晶。 （5）使IPG胶条重新水化
盖上盖子使IPG胶条在室温重新水化。进行水化至少用10小时，建议在晚上进行重新水化。若IPG胶条膨胀不均匀，请参照表11。 （6）准备固向干胶条设备。（ImmobilueＤryStrip Kit） 在IPG胶条从膨化托盘上移去前，根据3.5.2A和3.5.2B节中所述，准备Multiphor Ⅱ固向干胶条设备和电极胶条（Electrode Strips）。
表11在膨化托盘上进行IPG胶条重新水化故障及排除方法
症状（Symptom） 胶条膨胀不均匀
可能原因（PossibieＣause） 排除方法（Remendy） 注意：往往碱性端比酸性端膨化速度快。
失水的IPG胶条在室温或在高于室温的条件下储藏太久。
重新水化液的使用体积不正确。
重新水化时间太短。
不要让干燥的IPG胶条在室温下存留时间超过10分钟胶条会从空气中吸收水分，将IPG胶条密封好在-20℃以下温度保存。
搞清楚加入到膨化托盘上的槽中的正确溶液体积。 重新水化时间至少需要10小时。
3.5.2等电聚焦准备（IEF）
双向电泳固向干胶条设备的组成包括：一个托盘和电极支撑架，正和负电极，一个干胶条对准器，一把样品杯栅和样品杯。
在IPG胶条从膨化托盘移走前以下步骤A和B必须预先完成。 A．固相干胶条设备的准备
（1） 清洗所在的固相干胶条设备及附件。
固相干胶托盘，干胶对准器，电极，样品杯栅和样品杯，应当清洗干净备用，用去污剂清洗，并且用大量蒸馏水冲洗，然后干燥。 （2） 在MultiphorⅡ上检查电源连接。
检查在MultiphorⅡ设备上红色的连接线连接。 （3） 安装冷却装置
在Multi Temp Ⅲ静热循环仪上设置温度为20℃将冷却盘安置到Multiphov Ⅱ设备上，并确保表面是否水平。打开MultitempⅢ静热循环仪。 （4） 安装固相干胶托盘
用吸管吸取10ml左右的IPG覆盖夜到冷却盘上。将固相干胶托盘安装在冷却盘上，这样使托盘红色连接口位于冷却盘顶部的冷却管附近。除去托盘和冷却盘之间的大气泡，小气泡可以被忽略。IPG覆盖液在这里能使冷却盘和托盘之间接触良好，将红色和黑色电极插入到MultiphovⅡ设备的托盘上。 （5） 安装干胶对准仪
将15ml的IPG覆盖液倒入固相干胶托盘上。将干胶对准仪放入到托盘中，位于IPG覆盖夜上，使具有13条沟槽的一侧朝下。在干胶对准器下，胶条位置之间的气泡不会影响实验。在这时避免使IPG覆盖夜粘在对准仪上，这样会干扰各槽的显影。
B．准备电极条
（1） 将电极条切成一定规格
将两根IEF电极条切成110mm长度。 （2） 用蒸馏水将电极条湿润
将电极条放在干净的表面如玻璃皿，用0.5ml的蒸馏水使各电极胶条湿润。用滤纸将胶条的水吸去。
注意：电极胶条必须保持润湿而不是湿透水。过量的水能产生条纹。 注意：A 和B步骤必须在等电聚焦前完成。
C．电泳的准备
（1） 将水化后的IPG胶条从膨化托盘上移去
为了从膨化托盘槽中移去IPG胶条，沿着槽的倾斜一端划动镊子的尖端，并且使镊子尖端在IPG胶条下稍微向下压。用镊子夹住胶条的一端，并提起来，从托盘中拿出。 （2） 用去离子水冲洗IPG胶条
用镊子夹住IPG胶条，用去离子水流轻轻地快速冲洗IPG胶条。冲洗胶条为了除去胶条表面多余的重水化液，这样在等电聚焦过程中，可以防止在胶表面出现尿素晶体。将IPG胶条的一边放在潮湿的滤纸上几秒钟，从而吸去多余的水分，避免使凝胶的表面与滤纸接触。 （3） 在干胶对准仪（Drystrip ahgner）中安置IPG胶条
立即将水化后的IPG胶条转入到干胶托盘上的对准仪的相邻沟槽中，使胶条的成尖端（酸性）位于托盘上端接近红色的电极处。钝的一端应当位于托盘的另一端，接近阴极端。对准IPG胶条，使阳极的凝胶边缘成一条线。
（4） 安置电极条
安置潮湿的电极胶条，使胶条横贯已对准胶条的阳极和阳极两端，电极胶必须至少与各IPG胶条的表面部分接触。 （5） 安装电极（图12）
每个电极在边上标有红色（正极）或黑色（负极），在电极胶条上调准各电极，确保标注边与在托盘上给定电极接口的边对应。当电极正确调整后，向下压低电极，使电极与电极条接触，检查
IPG胶条依然在各自的沟槽中对齐。
D．任选：凝胶重水化后加样
若样品在胶条重水过程中没加样，在进行电泳前，可以利用样品杯进行加样，当使用样品杯时，加样的量就少了，并且，更具限定性。不同梯度和胶条的合适的加样量，在表12中给定。这些数据只能作为一般的参考，根据样品和所使用的染色方法的灵敏性，合适的加样量将会有很大的不同。 （1） 准备样品
在与使用的重新水化液具有相同成分溶液中准备样品。
表12用样品杯加样的合适样品量 固相干胶条（immobiline Drysfrip） 7cm 7cm 7cm 11cm 11cm 11cm 13cm 13cm 13cm 18cm 18cm 18cm 24cm 24cm 24cm
pH 4-7 pH 6-11L
pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L pH 3-10L pH 4-7L pH 6-11L
pH 3-10L PH3-10NL pH 4-7L pH 6-11L
pH 3-10L PH 3-10NL pH 4-7,3-7 pH 6-9,窄pH梯度 pH 3-10,3-10NL
合适加样量（ug蛋白质） 4-8(银染) 20-120(考染) 8-16 40-240 2-4 10-60 10-20 50-300 20-40 100-600 4-8 20-120 15-30 75-450 30-60 150-900 8-15 40-240 30-60 150-900 60-120 300-1500 15-30 75-450 45-49 200-1300 80-170 400-2000 20-40 100-600
（2） 确定加样点
最佳的加样点依赖于样品的特性，当感兴趣的蛋白质具有偏酸性的PI值或在样品预处理过程中使用了SDS，建议在接近阴极处设立加样点。带正电的样品进行加样需要PH6-11的梯度，最好使用PH3—10的梯度。由于样品的自然属性不同，最佳的加样点也可能各不相同。经验性的确定加样点位置是相当重要的。 （3） 安置样品杯栅
将样品杯放置在样品杯栅上，放在样品杯栅足够高的位置以避免接触凝胶表面。依据你的样品，调整样品杯栅的位置，使样品杯离阴极或阳极几毫米远。样品杯必须面对着电极。样品杯栅的一边具有一块垫片。向阳极或阴极移动样品杯栅，直至垫片正好接触阴极或阳极。