发布时间 : 星期三 文章双向电泳使用说明 - 图文更新完毕开始阅读
污染物 除杂原因 除杂技术
能在双向电泳谱相中出现。
超离心技术能将大分子的核酸除去，然而这种方法也能使大分子量的蛋白质除去。
在使用低离子强度抽提条件下，带负电的核酸有可能与带正电的蛋白质形成复合物。强离子强度或高PH值的抽提液能减少这种反应。
脂类（lipids）
许多种蛋白质，尤其是膜蛋白能与脂类结合，这样既能降低可溶性又能影响PH值和分子量，脂类与去污染剂成复合物，在作为蛋白质促溶剂时，能降低去污剂的作用。
当将富含脂类组织抽提液进行离心时，往往能看到脂层，很难被除去。
酚类化合物存在于植物组织中，并且通过催化酶氧化反应能修饰蛋白质。
高强度的变性条件和高浓度的去污剂能减少蛋白质一—脂反应。过量的去污剂是必要的。
利用丙酮沉淀法能除去一些脂类。
在组织液提取过程中，可以利用还原剂来防止酚类氧化物（DTT，巯基乙醇等）。
利用沉淀技术能迅速将蛋白质从酚类化合物中分开。
可以利用抑制剂来抑制聚酚类氧化。（如Thiourea、Diethyldith Iocarbamic Acid）
利用PVP或PVPP吸附剂的吸附将酚类化合物除去。
在进行第一向等电聚焦（IEF）前用离心法将样品纯化。
酚类化合物
(Phenoclic lompounds)
不溶物质
不溶物质能堵塞凝胶空隙，使聚焦质量下降。当使用样品杯加样时，不溶物质尤其是个问题，它能阻碍蛋白质进入IDG胶条。
2.5 样品溶液的组成
为了取得聚焦好的第一向分离，样品蛋白必须充分相互分开，并完全溶解。不管样品是否用相当粗的破碎方法或使用了额外样品沉淀过程，样品溶液必须含有某些成份，确保在进行第一向等电聚焦（IEF）前，使样品完全溶解和变性。这往往包括尿素以及一种或多种去污染剂。在附录中的细胞降解液中（溶液A）含有尿素和两性离子去污剂CHAPS，发现对许多种类的样品具有很好溶解作用。还原剂和IPG缓冲溶液经常被加入到样品溶液中，以提高样品的溶解度。
在变性条件下，进行等电聚焦（IEF），能得到最好的分离和最清晰的结果。尿素是一种中性的促溶剂，在双向电泳的第一向中被用作变性剂。在双向电泳第一向样品溶液中经常含有尿素，其浓度为8mol/l。尿素能使许多种蛋白溶解并舒展开来形成完全随机的结构，所有的离子基团暴露在溶液中。除了尿素、硫脲最近被发现能提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白。
为了确保样品的完全溶解和防止通过疏水反应而使蛋白质相互结合，在样品溶液中往往包含非离子或两性去污剂。原先使用NP-40和TRITOX-100这两种相尽的非离子去污剂。后来的研究证明，两性去污剂CHAPS的效果更好。非离子或两性去污剂使用的浓度达4%。
当使样品完全溶解发生困难时，阴离子去污剂SDS能被用做促溶药剂。SDS是一种相当有效的蛋白质促溶剂，但它由于能与蛋白质形成复合物并且带负电性，在双相电泳中，不能只使用这种去污剂来溶解样品。普遍使用的用来消取SDS干扰的方法是将样品在含有过量的CHAPS 、TRITOX-100或NP-40的溶液中稀释。最终SDS的浓度为0.25%或更低，过量的去污剂和SDS的比例至少为8：1[24.31、55]。
为了打断二硫键，并且使所有蛋白质处于还原状态，在样品溶液中往往加入还原剂。经常使用的还原剂为DTT，使用浓度为20—100mmol/l之间。DTE与DTT相近，也能用作还原剂。原先，巯基乙醇被用作还原剂，但是需要高浓度的还原剂，所以内含的杂质可能引起污染。最近，非硫类还原剂（tributylphosphine）被用作双向电泳的还原剂，使用浓度为2 mmol/l.[57]
载体两性电解质或 IPG缓冲液[达2%（ w/v）]能够被包含在样品溶解液中。通过电荷与电荷之间的反应减少蛋白质结合来增加蛋白质的可溶性。
样品在离心和随后的处理之前，应当将样品保留在样品溶液中在室温下维持1小时，使之充分变性和溶解。在有去污剂存在的样品，加热能促进样品的溶解，但是，只有在加入尿素之前才能加热，因为存在尿素时对样品加热，能在蛋白中插入电荷而使蛋白修饰。超声波能加快蛋白质溶解，尤其是来源于那些相当难再悬浮材料的样品。
广泛使用的样品溶解液是裂解液，在附录（溶液A）中给出。为进一步了解双相电泳蛋白溶解方面的材料请参考[12]。
第三部分 第一向等电聚焦
3.0 第一向等电聚焦概况
Amershum Pharmacia Biotech公司提供了进行第一向电泳分离的两套不同设备：MutiphorⅡ设备及附件和IPGPhor等电聚焦设备。两种设备对照在1.2节中给出。
进行一次有价值的第一向分离，需要选择适合于样品也适合于样品加样的pH值范围。固相PH梯度选择在3.2 节中介绍，样品加样的方法和这些方法的选择在3.3节中介绍。
第一向分离过程包括IPG 胶条的重新水化，加样和等电聚焦。IPG 胶条的重新水化液制备在3.4节中介绍。IPG胶条的重新水化，加样和等电聚焦规则在 3.5中描述，这些规则只适合于第一向电泳设备。其中3.5节主要讲述 MutxtiphorⅡ设备的规则，3.6节讲述 IPGPhor等电聚焦设备。
3.1 等电聚焦的背景
等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们整个分子要麽带有正电或负电，要麽不带电，这依赖于环境的pH值。整个蛋白质分子的带电量取决于组成蛋白质的氨基酸的侧链及碳端和氮端所有电荷总合。等电点是一个特定的pH 值，此时整个蛋白质分子的带电量为零。蛋白质在环境pH值低于pI时带正电，而高于pI值时带负电。若将蛋白质分子所带电量与环境PH值作图时，结果曲线在等电点处横截横坐标。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在PH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所带电荷为零的点移动。蛋白质若所带电荷为正，则它向阴极移动，在它到达pI点位置之前在它们通过PH 梯度时，其所带的正电荷会逐渐减弱。带负电的蛋白质则要向阳极移动，所带的负电荷会逐渐减弱直至为零。如果蛋白质偏离等电点，其立即带上电荷而返回等电点的位置。这就是等电聚焦(IEF)的聚焦效果，能将蛋白质在其pI点上浓缩及分开。并根据所带电荷微小的差异，能将蛋白质分离。
分离的程度取决于pH梯度和电场强度。因此，等电聚焦(IEF)是在相当高的电压下进行的（一般超过1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时，在整个体系中很少有离子的移动，从而使最终电流很低（往往低于mA）。给定样品在给定电泳体系中进行等电聚焦，一般要经过几个连续的电压时（电压时是在该点电压时，电压与电泳时间的乘积）。
等电聚焦在变性条件下进行，能产生很高质量的分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单分子存在，并且减少结合和分子间的相互作用。
原先的第一向等电聚焦依靠载体两性电解质在聚丙烯酰胺管胶内产生的pH梯度将蛋白质分离。[1，2]载体两性电解质分子非常小，易溶，在它们的PI值附近有很高的缓冲能力。商品化的载体两性电解质混合物是由在特定pH值跨度上具有等电点（pIs）的上百种单独的聚合物组成。当电压加到载体两性电解质混合物上时，低pI值的载体两性电解质向阳极移动，高pI值的则向阴极移动，其它的载体两性电解质根据它们的pIs值分别分布在这两极端之间，并且使其周围环境缓冲在相应的pH值上。结果产生连续的pH梯度。
尽管这种基础的方法被用于上百种双向电泳的研究，但具有一些限制它们更广泛使用的局限性：
■载体两性电解质是混合的多聚物，很难被很好第定性，并且受到批与批之间生产上的变动。这些变动降低了第一向分离的能力。 ■载体两性电解质pH梯度不稳定，并且具有漂移的趋势，在电泳过程中往往向阴极漂移。通过电泳时间变化，梯度漂移反过来能影响电泳的重复性。梯度漂移也能在pH梯度两端形成pH梯度消失而使pH值均匀，尤其是pH值高于9时，从而使在pH值两端使双向电泳技术失去作用。
■柔软的聚丙烯酰胺管胶的机械稳定性低。胶棒有可能被拉长或断裂，从而影响电泳的重复性。电泳结果好坏往往依靠操作者的熟练程度。
由于载体两性电解质梯度技术的局限性，一种可替代的pH梯度形成技术被发明了：固相pH梯度或IPG。这项技术在1982年由Biellqvist及其他成员所创的。在凝胶灌注时，将酸性和碱性的缓冲基团与聚丙烯酰胺凝胶形成共价结合而形成IPG。缓冲剂，被称作丙稀酰胺缓冲剂（Amershum Pharmacia BiotechimnmobilimeTM试剂），是一组易定性的分子，每一个丙稀酰氨单体都连