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在酶的提取分离过程中，应注意工艺的特殊要求。如在总的纯化要求上，蛋白质分离始终在温和条件下进行，而酶的分离在不破坏酶活力的限度内，可以采用“猛烈”手段，尽可能除杂。如：有蔗糖存在时，蔗糖转化酶能经受更高的温度。
另外，酶的催化活性是选择其提纯方法和操作条件的指标，整个过程都需测定总活力和比活力；收得率和纯度。
一.酶的分离与提取
(一）了解所分离酶在细胞中分布 细胞产生的酶有二类： 1.细胞外酶
由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶。这类酶大部分属于水解酶，通常含量高，容易得到。
2.细胞内酶
在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。
（二） 材料的获取
在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
（三）酶分离纯化的主要步骤（抽提、浓缩、纯化、结晶 ） 1.抽提
破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。
大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液pH最好远离等电点 。
2浓缩
抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。
3 纯化
（1）原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。
（2）分离纯化方法
a.盐析法（如硫酸胺） b.有机溶剂沉淀法
c.层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析） d.等电点法 e.吸附分离法 4. 结晶
浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。 二.酶活力及其测定
（一）酶活力定义 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。
（二）如何测定酶活力？初速度的测定是关键
（三）常用的酶活力单位
①在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下，每分钟能催化 1 mmol 底物转化成产物所需要的酶量定义为1个国际单位 (IU)。
②在最适条件下，每秒钟能催化1 mol 底物转化成产物所需要的酶量为 1个Kat 。
③自定义的活力单位
蛋白酶活力单位习惯定义：1个1min内将底物酪蛋白分解产生1μg酪氨酸的酶量。
淀粉酶活力单位习惯定义：1小时内水解1g淀粉的酶量。有的部门则采取每小时分解1ml2%的淀粉溶液的酶量为1个活力单位。
（四） 酶的比活力
比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量 （五） 酶的纯度
纯化倍数 =纯化后的比活力 / 粗抽提液比活力
产率(回收率) =纯化后的总活力单位 / 粗抽提液总活力单位 思考题
1. 某酶在一定条件下，5 min内使30 mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？ （每分钟能催化 1 mmol 底物转化成产物所需要的酶量定义为1个国际单位 (IU)）
2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？ 比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量
纯化倍数 =纯化后的比活力 / 粗抽提液比活力
产率(回收率) =纯化后的总活力单位 / 粗抽提液总活力单位 3.简述酶分离纯化的基本过程
A．抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 B．浓缩：（常用的浓缩方法）加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。
C．纯化：利用各种分离方法（盐析法、有机溶剂沉淀法、层析纯化法、等电点法吸附分离法）进行纯化。
D结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。 4 酶的制备及提取过程中应注意哪些事项 5 常用的酶活力单位？
U（指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量）、Kat（在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量）。1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat 6 比活力概念及意义
比活力用每毫克蛋白所含的酶活力单位数表示。 比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量
酶的比活力比活力代表酶制剂的纯度。对于同一种酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。
植物组织DNA的提取及其纯度浓度测定（CTAB法）
一 提取一般思路
? 破细胞膜（壁）
? 提取细胞器 ? 提取DNA ? 去除杂质
? 去除杂蛋白、脂类（酚、氯仿） ? 去除酚类（PVP、β-巯基乙醇） ? 去除糖类（NaCl、NaAc） ? 去除RNA（Rnase） ? 沉淀DNA（乙醇） ? 溶解DNA（TE） 二 原理
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的。细胞核中核酸通常与蛋白质结合形成复合物。绝大多数以脱氧核糖核蛋白复合物（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP和RNP，DNP与RNP在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。 RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl提取DNP。 用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，
最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。 三 提取原则
（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。
（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA的完整性。 四 DNA浓度的测定：
测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。 （1）计算纯度及浓度
OD260nm DNA浓度（μg/mL）＝
0.020×L ×稀释倍数
式中OD260nm为260nm处的光密度；L为比色杯光径（cm）；0.020为1μg/mL DNA钠盐的光密度。
260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50?g /ml双链DNA，33?g /ml单链
记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 （以上浓度单位为?g /ml）
（2）测定其OD260nm、OD230nm和OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2，OD260nm/ OD280nm≥1.8，表示RNA已经除净，蛋白含量不超过0.3％。 五DNA完整性测定： 琼酯糖凝胶电泳
凝胶的制备
样品的配制与点样 电泳
染色并观察其完整性 样品的回收与转移 思考题
1、从动植物细胞匀浆中提取基因组DNA时（参实验书P69）
常用EDTA,氯仿-异戊醇混合液和95％的乙醇试剂，根据蛋白质和核酸的性质回答： ⑴试验中这些试剂各起什么作用？
EDTA可螯合金属离子，抑制DNA酶的活性。
氯仿-异戊醇混和液使蛋白质变性沉淀，并能除去脂类物质。 95％的乙醇可使DNA沉淀。
⑵举出一种可以鉴定所提取基因组的DNA中是否残留RNA的方法？
采用地衣酚试剂检测RNA分子中的核糖。如果反应液呈绿色，说明残留有RNA。 采用紫外吸收法检测A260/280的比值，如大于1.8~1.9，说明残留有RNA。 采用琼脂糖凝胶电泳检测是否有小分子的RNA条带存在。 2、制备的DNA在什么溶液中较稳定?
制备的DNA在：（1）含有螯和剂如EDTA中较稳定，因为EDTA能螯合Mg或Mn离子，抑制DNase；（2）在pH5～9之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA的结构；（3）有一定离子强度（强度越高, DNA越稳定）的溶液中较稳定。（TE满足以上要求, 但如需对所得DNA进行酶切, EDTA浓度不可过高, 一般用0.1×TE或0.2×TE）。
3、为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
为了保证植物DNA的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解；（2）当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、 ㈠理论
1. 简述醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白基本原理。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。
2.如果样品液中含有三种蛋白质A、B、C，它们的等电点和分子量分别是MrA：36KD，pIA：5.2；MrB：60KD，pIB：6.5；MrC：28KD，pIC：4.7。在pH8.6，静电场80V条件下，
蛋白质电泳实验复习题
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