发布时间 : 星期六 文章2012CB910100-G-代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制更新完毕开始阅读
络在常态和病态下的结构组成和动态变化。如何建立和完善适用的计算生物学方法，从海量的生物化学数据中提取有用的与肿瘤相关的信息并在蛋白质与代谢物水平进行整合是本部分重要研究内容之一。 3. 蛋白质乙酰化修饰的上游调控酶SIRT及乙酰化酶功能及调控的上下游机制及其在代谢物调控中的作用及生理意义。主要研究：（1）在肝癌HepG2细胞中，研究SIRT1和p300调控的乙酰化修饰水平是否影响肝癌细胞脂肪酸合成和细胞增殖，以及ChREBP的表达和转录活性是否在其中发挥重要作用；（2）比较ChREBP敲除鼠（已有）和野生型小鼠在化学致癌剂（二乙基亚硝胺，DEN）和高脂饮食条件下肝癌发生的异同，并进一步研究肝脏不同乙酰化水平对于以上小鼠模型中肝癌发生的影响；（3）比较100例左右肝癌病人的肝癌组织及其正常肝组织的Sirt1，p300和ChREBP的mRNA和蛋白水平以及ChREBP的乙酰化水平，寻找其中变化规律及其与肝癌细胞增殖和病人各项生理指标的关系。
三、利用分子细胞生物学、生物化学方法，我们将主要研究代谢酶的乙酰化与磷酸化等翻译后修饰调控代谢的分子机制，以及代谢中间物通过影响下游蛋白质翻译后修饰调节细胞信号通路的分子机制。
1. 通过培养的细胞系研究乙酰化、磷酸化等翻译后修饰对代谢酶的调节作
用。选用代谢相关组织的细胞系HEK293（肾细胞）、HepG2（肝细胞）和U87MG（神经胶质瘤细胞）等作为实验材料开展培养细胞的各项试验；采用第一、第二类去乙酰化酶（HDACs）抑制剂TSA（5?g/ml）与第三类去乙酰化酶（SirTs）抑制剂Nicotinamide（5－10mM）同时处理细胞或病理样品以获得不同乙酰化水平的蛋白质，研究乙酰化对代谢酶生化性质的影响；用NaF或Vanadate抑制磷酸
酶活力，研究磷酸化对蛋白功能的调控；采用western blotting方法检测蛋白质的乙酰化、磷酸化、甲基化或羟基化，采用自制或商业购买的抗乙酰化赖氨酸探测，用GE公司的ECL plus显色，GE公司的Typhoon Trio扫描仪检测；采用siRNA或shRNA方法对需要敲落的相关基因进行敲落，采用knock in，overexpress等方法在细胞中表达需要的基因。采用Tandem Affinity Purification （TAP）及免疫共沉淀技术鉴定及确认参与代谢酶乙酰化的修饰酶；各个代谢酶、代谢酶修饰酶（乙酰化酶及去乙酰化酶）以及各种双加氧酶（PHD、组蛋白去甲基化酶、DNA去甲基化酶）的酶活的测定将按照文献方法进行。
2. 通过培养的细胞系研究代谢物对细胞表观遗传及下游信号通路的调控。通
过外源添加细胞膜可渗透的代谢物衍生物，如酯化的?酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酸等，改变细胞内的特定代谢物的浓度，检测组蛋白甲基化水平、DNA甲基化水平以及包括HIF家族在内的蛋白羟基化水平，同时研究因这些改变导致的下游效应，生化检测方法同上；在改变细胞代谢物浓度的条件下运用microarray、Chip seq 等手段研究因代谢中间物改变引起的组蛋白或DNA甲基化变化调控的下游基因表达变化以及蛋白与细胞核内不同功能DNA区段的互作情况，并运用生物信息学方法进行分析和数据整理。
3. 建立动物模型研究翻译后修饰对于代谢的调控，以及修饰失调的病理效
应。在小鼠模型中敲除/敲入特定的一个或数个修饰酶/代谢酶，研究这些改变对于小鼠代谢组、信号通路的影响。重点研究可加强/抑制Warburg effect的乙酰化调控动物模型的肿瘤发生率的改变；研究通过改变乙酰化修饰酶调节细胞?酮戊二酸、延胡索酸、琥珀酸的动物模型，研究这些改变对于肿瘤发生的促进/抑制作用。
4. 选用人肝癌、胃肠道癌、神经胶质瘤等肿瘤标本确认乙酰化蛋白质翻译后
修饰、细胞表观遗传性状以及相关信号通路在肿瘤发生过程中发现了改变。用免疫组化方法研究蛋白质、蛋白质乙酰化、蛋白质甲基化、DNA甲基化以及蛋白质羟基化的改变；用deep sequence研究修饰酶或其他基因的突变；通过检测样品中蛋白质的磷酸化水平等方法研究是否有信号通路改变。
四、用结构生物学方法研究蛋白质修饰酶功能活性及特异性调控
的结构基础。 1. 研究双加氧酶的催化机制，以及各种小分子，如系统研究代
谢中间物α-KG等，是如何影响各种修饰酶对底物的识别和催化活性的调控 我们将重点解析以双加氧酶相关蛋白复合体的结构与功能。我们将采用共结晶的方式获取代谢中间物（如α-KG、2HG）与双加氧酶 （CeKDm7A JmjC结构域）和组蛋白底物 （如H3K9me2、 H3K79me2等）相互作用的蛋白质复合体晶体的并解析其结构。我们还将研究这些小分子代谢中间物与其它双加氧酶如hJDM1A等形成复合体的晶体结构，通过比对这些不同双加氧酶复合体的结构特点，研究不同家族中双加氧酶的底物特异性识别机制。 我们将深入探索寻找调控蛋白修饰功能（如小分子肿瘤抑制化合物）的分子途径，继续双加氧酶与代谢中间物（如α-KG和2HG）不同类型衍生物的结构与功能的研究，并将各种衍生物小分子对双加氧酶结构域的识别进行详细对比研究。我们将通过对结构与功能之间存在的密切关系的研究来阐述各种衍生物小分子是如何识别并控制双加氧酶其结合的强度和特异性，且如何诱导相应的构象变化来决定双加氧酶的激活状态。这些都是酶特异性抑制剂设计的核心问题，解决了这些问题，将会使我们能为不同信号通路引起的疾病提供针对性的治疗靶子。 2. 研究蛋白质修饰酶全酶或多个结构域
的活性调节的分子机制
这些修饰酶中许多都含有能对特定修饰基团进行结合和催化修饰等不同功能的结构域。目前为止，这些染色质修饰酶的结构研究大部分都是对单独功能结构域的研究，尤其是蛋白催化核心结构域。但是，多个结构域是如何相互作用来协调完成蛋白修饰的？各种修饰酶在不同复合体中的空间排布及结构调控机制存在什么样的机制和差异？与相对保守的催化活性结构域不同的是，修饰酶的其他区域具有较大的非保守性和多样性。不同调控小分子, 如α-KG等, 是如何影响各种修饰酶多个结构域的空间排布及构象变化来对底物的识别和催化活性进行调控的？不同的多个结构域的空间排布及构象变化对最终调控的病理生理反应具有什么功能？这些问题，都需要我们提供清楚详细的多结构域的完整三维晶体结构以及结构与功能的构效关系的研究数据来解释。因此，解决多结构域的完整结构将是修饰酶结构生物学研究领域的重点。 LSD1/KDM1的结构研究，展示了含有三个不同结构域的蛋白的空间结构：N端SWIRM结构域、中间的Tower结构域和C端的类似氨基酸氧化酶的结构域AOL(amine oxidase-like)。除了JmjC结构域，大部分含JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基酶都含有PHD指状结构域，表明它们可能与蛋白-DNA的结合有关。我们将继续对代谢中间物（如α-KG和2HG）与含有多个结构域的各种双加氧酶形成复合体的结构与功能的研究。这些结构，将会清晰揭示代谢中间物是如何组织双加氧酶空间结构并如何与底物结合，更重要的是，这些结构将会清楚解释，代谢中间物是如何将调控信号传递到修饰酶的特异DNA靶点，调控特异基因的表达，系统的阐明相关信号转导通路的结构功能机理。 3. 蛋白修饰酶与核受体转录因子相互调控的结构及调控机制 蛋白修饰酶的活性与特异性受各种蛋白及小分子的多重调节， 从而参与对不同靶基因表达