发布时间 : 星期六 文章流行性感冒病毒核酸检测试剂注册申报资料技术审评指导原则(征求意见稿2)201107更新完毕开始阅读
6．对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。
7.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。 另外，对于试剂盒的对照（质控）品设臵，建议企业参考以下要求执行：
（1）流感病毒核酸检测试剂盒的外部对照（质控）品应至少设臵临界阳性对照（质控）品和阴性对照（质控）品，均应参与样本核酸的平行提取，以对整个RT-PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种对照（质控）品的Ct值做出明确的范围要求。注意，建议采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照（质控）品，不推荐采用水作为阴性对照（质控）品。
（2）样本反应管应设臵合理的内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线但又不能对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性。对内标的Ct值也应有明确的范围要求。
（3）关于对照品的原料选择：内对照（内标）应采用具有蛋白外壳的病毒颗粒，如灭活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒），外部阳性对照可以采用灭活病毒、假病毒或质粒。
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（七）分析性能评估资料
企业应提交原厂在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、试验数据、统计方法等详细资料。对于流感病毒核酸类定性检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。
1、流感病毒核酸（RNA）提取
病毒RNA提取主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，决定RT-PCR成败的关键环节。RNA极易受RNA酶（RNase）的降解，而临床标本和实验室环境中存在大量的RNase，因此，无论申报产品是否含有RNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于RNA提取试剂的选择，除最大量分离出目的RNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。传统的RNA分离纯化方法（如表面活性剂加蛋白酶结合氯仿-酚抽提法）和改良方法（如硅磁性微粒吸附法）均有或多或少的优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择RNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
2、最低检测限（分析灵敏度） （1）最低检测限的确定
建议使用培养后病毒原液的梯度稀释液进行最低检测
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限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3-5份，每份进行不少于20次的重复检测，将具有90%-95%阳性检出率的病毒水平作为最低检测限。通过另制备至少5份最低检测限浓度水平的病毒稀释液对90%-95%的检出率进行确认。建议采用半数组织培养感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50）或空斑形成单位（plaque forming units，PFU）法进行病毒滴度的滴定，并采用上述两种方式作为病毒浓度的表示方式。在进行最低检测限的确认时，参与研究的甲型流感病毒各亚型和乙型流感病毒应至少包括不同来源的两个具有代表性的病毒株的系列稀释梯度。
（2）最低检测限的验证
申报试剂应在最低检测限或接近最低检测限的病毒浓度对每种常见待测流感病毒亚型具有时间和区域特征性的至少3个病毒株进行验证。对此，企业应能够提供用于最低检出限验证的各个病毒株的来源、型别确认及滴度确认试验等信息。用于最低检测限确定和验证的病毒株如包括疫苗株，则其应能够体现最近流感发病季的病毒特点。
3、分析特异性 （1）交叉反应
①用于流感病毒核酸检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的
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其他微生物。
②建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为10 cfu/ml或更高，病毒为10 pfu/ml或更高。
③首先，应在流感病毒不同型别和亚型间进行交叉反应验证；其次，采用其它的病原微生物进行验证（见表1）。
④申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
表1 建议用于交叉反应性研究的微生物
微生物 类型 3型 7型 1、2、3型 B型 1A型 18
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腺病毒 腺病毒 人冠状病毒 巨细胞病毒 肠道病毒 人副流感病毒 麻疹病毒 人偏肺病毒 流行性腮腺炎病毒 呼吸道合胞病毒 鼻病毒 百日咳杆菌 肺炎衣原体 棒状杆菌* 大肠杆菌* 流感嗜血杆菌 乳杆菌* 卡他莫拉菌* 无毒结核分枝杆菌 肺炎支原体 脑膜炎奈瑟菌