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机械法破碎细胞 机械法—高压匀浆
原理：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬浮液速度可达几百米每秒，
高速喷出的浆液喷射到静止的撞击环上，
细胞在高速造成的剪切力，碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造成细胞破碎。 机械法—珠磨
原理：细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎。 机械法—超声波
破碎原理：一般认为在超声波作用下液体发生空化作用。液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 非机械法—酶解
概念：利用酶促反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。
酶解法专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。 几种主要的酶
细菌：主要用溶菌酶
酵母和真菌： 蜗牛酶、纤维素酶
植物细胞： 纤维素酶、半纤维素酶，果胶酶 特点：优点：专一性强，发生酶解的条件温和。
缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 非机械法—渗透压冲击
概念：是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡。
介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。
非机械法—冻结-融化
概念：将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。 非机械法—化学法
概念：用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。
非机械法—其他：噬菌体裂解法 破碎方法的选择
一 机械法各自的特点 方法 技术 原理 效果 成本 适中 便宜 昂贵 适中 举例 动物组织及动物细胞 细胞悬浮液小规模处理 细胞悬浮液大规模处理 机械法 匀浆法（片型） 研磨法 超声波法 匀浆法（孔型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 细胞被研磨物磨碎 适中 用超声波的空穴作适中 用使细胞破碎 细胞通过的小孔，受剧烈 到剪切力而破碎
珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁剧烈 珠捣碎 便宜 细胞悬浮液和大规模处理 3、包涵体的概念
包涵体是指工程菌表达的目标产物蛋白在细胞内凝集，形成的无活性固体颗粒。 这些产物的一级结构正确，但高级结构却是错误的。 包涵体的形成
包涵体的形成主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的 。
形成原因—表达量高
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 形成原因—氨基酸含硫过高
重组蛋白的氨基酸组成：
一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 形成原因—环境不适合
重组蛋白所处的环境：
发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
形成原因—异源蛋白
重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白
由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
思考题：
发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？
请对机械法和非机械法在进行细胞破碎时特点进 行比较 何谓包涵体，包涵体有何特点，产生原因有哪些？ 第四章 沉淀技术
1、维持蛋白质胶体稳定的因素
（1）蛋白质周围的水化层（2）蛋白质分子间的静电斥力
2、盐析的概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
3、盐析与变性的关系：盐析是可逆的，变性是不可逆的
不同盐浓度下盐的作用：低离子强度下的盐溶 ，向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层，导致蛋白质的溶解度增大，发生盐溶高离子强度下的盐析由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用
4、盐析法的机理：减弱蛋白质分子周围的水化膜层 大量中和蛋白质表面电荷 5、蛋白质溶解度与盐浓度的关系（低高浓度） 盐析公式——cohn经验式
? 盐析公式：logS=β-KsI S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度
? 离子强度公式：
c:离子浓度； Z:离子化合价
? 盐析公式——β含义
?
β— 盐浓度为0时（纯水中溶解度），蛋白质溶解度的对数值。 与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； ? 盐析公式——Ks含义
?
Ks—盐析常数
与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 ? 盐析公式—局限性
虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。
6、用盐析法分离蛋白质的二个步骤 Ks盐析法：
在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；
Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
β盐析法：
在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；
β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
影响因素—无机盐
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 ? 各种盐对碳氧血红蛋白的β和Ks值 项目 β Ks 磷酸钠 3.01 1.00 硫酸钠 2.53 0.76 硫酸铵 3.09 0.71 柠檬酸钠 2.60 0.69 硫酸镁 3.23 0.33 思考：通过以上数据进行比较，哪种盐对碳氧血红蛋白沉淀效果最好
7、等电点沉淀法原理：在低离子强度下，调节pH值至等电点，蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。
8、有机溶剂沉淀法的原理：降低了溶质的介电常数，削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀。
常用的有机溶剂沉析剂 常用有机溶剂种类
乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的 沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；
其它沉淀法：有机聚合物沉淀法、选择性变性沉淀法、亲和沉淀 思考题
理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 沉淀与结晶的相同点和不同点？
盐析法和有机溶剂沉淀蛋白质的机理各是什么？两种方法沉淀蛋白质时需要注意什么问题。
第五章 萃取技术
1、萃取相，萃余相，分配常数，活度，分配系数，萃取因素，萃取分率，萃余分率 分配常数A 萃取的概念：当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配。
萃取法：利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离目的的方法 萃取相关的概念
料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液， 溶质：其中欲提取的物质， 萃取剂：用以进行萃取的溶剂，
萃取液：大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液， 萃余液：被萃取出溶质后的料液。
分配常数是以相同分子形态(相对分子质量相同)存在于两相中的溶质浓度之比。但在多数情况，溶质在各相中并非以同一种分子形态存在。
分配系数K：萃取过程中常用溶质在两相中的总浓度之比表示溶质的分配平衡，该比值称为分配系数。很明显，分配常数是分配系数的一种特殊情况。
分离因素β：如果原来料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同，萃取相中A和B的相对含量就不同于萃余相中A和B的相对含量。如A的分配系数较B大，则萃取相中A的含量（浓度）较B多，这样A和B就得到一定程度的分离。 萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素（β）来表征。
? β=1 KA = KB 分离效果不好 ? β>1 KA > KB 分离效果好
? β越大，KA 越大于KB，分离效果越好。
2、分配定律及其应用条件：
分配定律：一定T 、P 下，溶质在两个互不相溶 的溶剂中分配，平衡时，溶质在两相中浓度之比为常数，该常数称为分配常数。
应用前提条件：稀溶液、溶质对溶剂互溶没有影响、必须是同一分子类型 ，不发生缔合或离解
3、pH与弱电解质在有机相和水相中的分配系数 之间的关系，从中能得到哪些与弱电解质萃取操作相关的结论，pH、pK与电解质解离的关系