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〔四〕循环芯片测序被称为第二代测序技术 〔五〕单分子测序技术被成为第三代测序技术 二、基因转录起点分析技术
〔一〕用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS
〔二〕用5－cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS 〔三〕用数据库搜索TSS
三、基因启动子结构分析技术
〔一〕用PCR结合测序技术分析启动子结构
〔二〕用核酸－蛋白质相互作用技术分析启动子结构 1、用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点
2、用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子 〔三〕用生物信息学预测启动子
1、用启动子数据库和启动子预测算法第一启动子 2、预测启动子的其他结构特征 四、基因编码序列分析技术
〔一〕用cDNA文库法分析基因编码序列 〔二〕用RNA剪接分析法确定基因编码序列 〔三〕用数据库分析基因编码序列 五、基因拷贝数分析技术
第二节 基因表达产物分析技术
一、通过检测RNA而在转录水平分析基因表达 〔一〕用核酸杂交法检测RNA表达水平 1、用RNA印迹分析RNA表达
2、用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况 3、用原位杂交进行RNA区域定位 〔二〕用PCR技术检测RNA表达水平
1、用逆转录PCR进行RNA的半定量分析 2、用实时定量PCR进行RNA的定量分析
〔三〕用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平 1、基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 2、用循环芯片测序技术分析基因表达谱
二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达 〔一〕用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽 〔二〕用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽
〔三〕用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽 〔四〕用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞
〔五〕用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平 1、用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱 2、用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱
第三节 基因的生物学功能鉴定技术
一、用功能获得策略鉴定基因功能 〔一〕用转基因技术获得基因功能
〔二〕用基因敲入技术获得基因的功能 1、用RNA干扰技术研究基因功能 2、用miRNA技术研究基因功能 3、用反义RNA技术研究基因功能 4、核酶技术
二、用功能失活策略鉴定基因功能
〔一〕用基因敲除技术使基因功能完全缺失 〔二〕用基因沉默技术可使基因功能部分缺失 三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能
第二十三章 癌基因、肿瘤抑制基因与生长因子
第一节 癌 基 因
一、癌基因的基本概念 〔一〕细胞癌基因 〔二〕病毒癌基因
二、癌基因活化的机制
〔一〕获得强启动子或增强子 〔二〕染色体异位 〔三〕基因扩增 〔四〕点突变
三、原癌基因的产物与功能 〔一〕细胞外生长因子 〔二〕跨膜生长因子受体 〔三〕细胞内信号转导分子
四、癌基因表达产物促进肿瘤发生发展 〔一〕BRAF 〔二〕HER2
〔三〕BCR－ABL
第二节 肿瘤抑制基因
一、肿瘤抑制基因的发现 二、肿瘤抑制基因的功能
三、肿瘤抑制基因失活促进肿瘤发生发展 〔一〕RB基因 〔二〕TP53基因 〔三〕PTEN基因
四、肿瘤抑制基因与疾病
五、癌基因与肿瘤抑制基因在肿瘤发生中的作用特点 〔一〕细胞癌变的多基因协同
〔二〕细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键 1、癌基因核肿瘤抑制基因与细胞周期 2、癌基因、肿瘤抑制基因与细胞凋亡
第三节 生长因子
一、生长因子的分类与功能 〔一〕生长因子的分类 〔二〕生长因子的功能 二、生长因子的作用机制 〔一〕生长因子与肿瘤
〔二〕生长因子与心血管疾病 1、原发性高血压 2、动脉粥样硬化 3、心肌肥厚
第二十四章 疾病相关基因的鉴定与基因功能研究
第一节 鉴定疾病相关基因的原则
一、鉴定疾病相关基因的关键是确定疾病表现型和疾病间的实质联系 二、鉴定克隆疾病相关基因需要多科学多途径的综合策略 三、确定候选基因是多种克隆疾病相关基因方法的交汇
第二节 疾病相关基因克隆的策略和方法
一、不依赖染色体定位的疾病相关基因克隆政策 〔一〕从已知蛋白质的功能和结构出发克隆疾病基因
1、依据蛋白质的氨基酸序列信息鉴定克隆疾病相关基因 2、用蛋白质的特异性抗体鉴定疾病基因
〔二〕从疾病的表现型差异出发发现疾病相关基因
1、RDA技术是建立在核酸差异杂交基础上的PCR技术 2、mRNA是技术和聚丙酰胺凝胶电泳技术的结合 〔三〕采用动物模型鉴定克隆疾病相关基因 二、定位克隆是鉴定疾病相关基因的经典方法 〔一〕基因定位的方法有多种
1、体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因
2、染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法 3、染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法 4、连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法 〔二〕定位克隆的基本程序包括三大步骤 1、尽可能缩小染色体上的候选区域 2、构建目的的区域的物理图谱 3、疾病相关基因的确定
〔三〕假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证 三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序 四、生物信息数据库储藏丰富的疾病相关基因信息
第三节 疾病相关基因的功能研究
一、基因对比及功能诠释
二、利用工程细胞研究基因功能
〔一〕采用基因重组技术建立基因高表达工程细胞系
〔二〕基因沉默技术抑制特异基因的表达
三、研究生物大分子间的相互作用可确定基因功能 四、利用基因修饰动物整体研究基因功能
第二十五章 基因诊断和基因治疗
第一节 基因诊断
一、基因诊断的主要对象和样品来源 二、基因诊断技术
〔一〕基因缺失或插入的诊断 1、DNA印迹法 2、PCR技术
〔二〕基因点突变的诊断
1、等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 2、反向点杂交
3、变性高效液相色谱 4、DNA序列分析
三、基因诊断的医学应用
〔一〕遗传性疾病诊断和风险预测 〔二〕多基因常见病的预测性诊断 〔三〕传染病原体检测 〔四〕疗效评价和用药指导
〔五〕DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术
第二节 基因治疗
一、基因治疗的基本策略
〔一〕缺陷基因精确的原位修复 〔二〕基因增补
〔三〕基因沉默或失活 二、基因治疗的基本程序 〔一〕选择治疗基因
〔二〕选择携带治疗基因的载体 1、逆转录病毒载体 2、腺病毒载体
〔三〕选择基因治疗的靶细胞 1、造血干细胞
2、皮肤成纤维细胞
〔四〕将治疗基因导入人体 〔五〕治疗基因表达的检测 三、基因治疗的临床应用现状 1、单基因遗传病的基因治疗 2、针对多基因的基因治疗
第二十六章 组学与医学