发布时间 : 星期六 文章高效纤维素降解菌的选育 - 图文更新完毕开始阅读
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镁0.5 g，葡萄糖20.0 g，水1000 ml。
(9) 基础培养基：(NH4)2SO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaH2PO4·.H2O 0.5 g, CaCl2·2H2O 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，蒸馏水1000 ml，pH 6.5。
(10) 明胶液化培养基：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖20.0 g，明胶 200 g，蒸馏水1000
mL，pH 7.2-7.4，121 ℃灭菌20 min。
(11) 淀粉水解琼脂培养基：可溶性淀粉 20.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1.0 g，琼脂 20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4，121 ℃灭菌20 min。
(12) 纤维素水解培养基：MgSO40.5 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，KNO31.0 g，
蒸馏水1000 ml，pH 7.2，滤纸条(长6 cm，宽1 cm)，分装于试管中，将滤纸条加入试管中，一半浸在液内，一半露在液面外，121 ℃灭菌20 min。
(13) 硝酸盐还原培养基：琥珀酸钠 10 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 1 g，MgSO40.5
g，KCl 0.2 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2，分装于试管中，121 ℃灭菌20 min。
(14) 碳源利用培养基：(NH4)2SO42.64 g，K2HPO45.65 g，KH2PO42.38 g，
MgSO4·7H2O 1.00 g，CuSO4·5H2O 0.0064 g, FeSO4·7H2O 0.0011 g，ZnSO4·7H2O 0.0015 g，MnCl2·4H2O 0.0079 g，蒸馏水1000 mL，pH 自然值。将其分装在10个试管中，并在试管中分别加入1%D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露醇、L-肌醇、L-阿拉伯糖和鼠李糖， 121 ℃灭菌20 min。其中，蔗糖易在高温下被分解为葡萄糖和果糖，故采用过滤除菌的方法灭菌。
(15) 柴斯纳琼脂培养基：蛋白胨10 g，柠檬酸铁0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水 1000 mL，121 ℃灭菌20 min。
(16) 保藏用真菌PDA培养基(g/l)：200 g马铃薯加水1000 mL煮费后，再小火煮30 rnin，8层纱布过滤，加蔗糖20 g，补水1000 ml，pH 6.5。
2.4 菌种的分离与筛选 2.4.1 分离与初筛菌株的方法：
(1) 配CMC培养基，灭菌，倒平板。
(2) 制备土壤稀释液：称取土样10 g，放入盛90 ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。
(3) 划线：用接种针蘸取适量稀释液在平板上划线，每个平板划3到5条线。 (4) 培养将培养基平板倒置于28 ℃温室中培养3日。
(5) 挑菌：将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上，置28 ℃-29 ℃温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，将菌落用l mg/l果红染色5 min，将颜色变红的菌落继续划线分离。检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染
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色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。
(6)观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况及菌落形态等。
2.4.2 菌株的复筛
（1）配CMC培养基，灭菌，倒平板。
（2）划线：用接种针挑取适量初筛的菌种在平板上划线，每个平板划3到5条线。 (3) 再次挑菌：将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上，置28 ℃-29 ℃温室中培养，待菌苔长出后，观察水解圈情况，将菌落用l mg/l果红染色5 min，将颜色变红的菌落继续划线分离。检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。
(4) 观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况。
2.5 纤维素酶活性测定
2.5.1 绘制葡萄糖标准曲线
原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在540 nm处的吸光度，得出还原糖的量。
配制方法：将葡萄糖放在80 ℃烘干箱内烘干至恒重，然后精确称取0.040 g葡萄糖固体溶解于少量蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至20 ml，充分混匀，得浓度为2 mg/ml的葡萄糖标准溶液。
标准曲线的绘制：用1000 ml移液枪分别量取0 μl、200 μl、400 μl、600 μl、800 μl、1000 μl、1200 μl于7个干净的20 ml刻度试管中，用蒸馏水定容，得到浓度分别为：0 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、l00 μg/ml、120 μg/ml的葡萄糖溶液。各取4 ml加入到已作好标记的带有刻度的试管中，再分别加入DNS试剂2 ml，加热煮沸5 min，取出置冷水中冷却，定容至6 ml，在722型分光光度计上测量吸光值(波长为540 nm，以浓度为0 μg/ml的葡萄糖反应液体作空白对照)。
2.5.2 粗酶液的制备
在250 ml三角瓶中装50 ml培养基，将各菌株接种，30 ℃，旋转摇床振荡培养24
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h作种子液。用1000 μl移液枪量取500 μl转接于250 ml三角瓶中的50 ml培养基中，于30 ℃振荡培养48 h，在4 ℃，8000 r/min离心20 min除去菌体。取上清液作为4 ℃保存待用。
2.5.3 酶活力测定方法
关于纤维素酶活力的测定方法很多，至今也没有统一定论，而且用不同方法测定，结果也存在一定差异。Teather等认为，对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线性关系，产酶越多，透明圈越大；产酶越快，透明圈出现越早。然而，虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力。试验表明，液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系，可以对酶活进行初步定量，但不能作为菌株产酶活力大小的唯一定量指标。因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小、菌苔在平板上的堆积情况、菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制、不同菌株生长和产酶速度、不同细菌细胞壁的特性等因素的影响，并不能精确反应纤维素酶活力的大小[15]。因此本试验最初以水解圈的大小来判定纤维素降解能力，进而筛选出纤维素降解能力较强的菌株。 2.5.3.1 CMC酶活测定
酶活力测定中大都采用DNS法来测定还原糖的生成量，因为该法简易、灵敏度较高，但是由于纤维材料水解的是包括葡萄糖、纤维二糖及几种纤维寡糖的混合物，因此以葡萄糖为标准反映出的还原糖生成量与实际还原糖的生成量有一定的差异，这种差异很小，一般的定糖方法无法解决，只有用高效液相色谱(HPLC)等分析方法才能实现[16]。由于实验条件和时间的限制，本试验以葡萄糖为标准测定还原糖含量，不考虑不同还原糖的差异。因此本试验采用DNS法来测定纤维素酶活力的大小，具体操作方法如下：
以2 ml 1.0 %CMC溶液为底物(用pH为4.4，浓度为0.2 mo1/l Na2HP04, 0.1 mol/l柠檬酸缓冲液配制)，加200 μl上清液，再加2800 μl蒸馏水，于50 ℃保温30 min，然后加人2 ml DNS试剂，沸水浴5 min，然后一起放入凉水至室温，在540 nm测光密度值(OD540nm)，以相应空白样(2 ml1.0%CMC溶液为底物，3 ml灭菌的发酵培养液，于47 ℃保温30 min，然后加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，然后一起放入凉水至室温。
2.5.3.2 FPA酶活测定
取0.5 ml适当稀释的酶液，加入PH 4.4，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2 ml，加卷曲的
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瓦特曼滤纸（1 cm×6 cm）一条，于50 ℃酶解1 h，加入2.5 ml DNS显色液于沸水浴5 min，冷却后在540nm下测吸光度，酶液空白为将酶液于100 ℃处理15 min，按上法测定，酶活力单位(U)为mg葡萄糖/h。
2.5.4 酶活力计算方法
葡萄糖浓度计算公式：
根据葡萄糖标准曲线，将吸光度值代入一元线形回归方程，即可得到葡萄糖的浓度：x=(y+b)/k(ug/m1) ;x代表横坐标葡萄糖的生成量，葡萄糖浓度换算公式，见公式(2.1)：
x2=4x1/3 ; (2.1) y代表纵坐标，b代表截距，k代表斜率；xl代表利用葡萄糖标准曲线获得的相应葡萄糖浓度；x2代表酶液作用一定量底物后生成的葡萄糖的浓度。 根据酶活力定义得，酶活力计算公式(2.2)：
U=x/t*u (2.2) ---U代表酶活，---t代表酶作用时间，---u代表稀释度
酶活力单位定义为：在测定条件下，分解l% CMC溶液每分钟产生l μg葡萄糖定义为1个纤维素酶活力单位。
筛选出产纤维素酶活力较高的菌株作进一步的鉴定和产酶条件的研究。
2.6 形态特征观察
2.6.1 菌落形态观察
纯化了的菌株分别划线和点种于平板上，30 ℃培养，观察菌落形态。
显微镜水浸片观察法：取干净载玻片，加无菌水一滴，用接种环挑取少量菌体放入无菌水中，盖好盖玻片，镜检。
2.6.2 培养特征观察
将菌株分别接种在CMC培养基平板上，于30 ℃培养，分别于7 d、15 d和30 d肉眼观察其培养特征及颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据，观察和记录如下项目：
① 气生菌丝体颜色(指孢子丝未形成前的颜色)； ② 孢子丝和孢子的颜色(即成熟孢子堆的颜色)； ③ 基质菌丝体的颜色(即菌落背面的颜色)。
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