发布时间 : 星期一 文章靶向MRP1基因pRNAT-H1.1以及shuttle-RFP重组质粒表达载体构建 - 毕业设计论文-精品 - 图文更新完毕开始阅读
齐齐哈尔大学毕业设计(论文)
由于RNAi技术的高效性和高度特异性，RNAi已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段，并为基因治疗开辟了新的途径。现RNAi已广泛应用到HIV、病毒性肝炎、基因治疗及药物筛选探索中，对肿瘤细胞多药耐药性干扰作用的研究也正在迅速发展中，随着研究的深入和发展，将为MRP细胞的逆转提供一个安全有效的途径。
1.6 本论文的研究目的及意义
癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。
本实验针对mrp1基因设计并合成了两对能编码siRNA的DNA片段，进而构建pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达穿梭载体，为研究以RNAi技术逆转肿瘤细胞多药耐药提供实验基础。
1.7 本论文的主要内容
依据研究的目的及实验思路，本论文主要内容包括
1．根据肿瘤细胞的mrp1基因核苷酸序列，按照靶位点的寻找原则，设计并合成2个编码shRNA的DNA模板sh-mrp1-1和sh-mrp1-2。
2．pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒的大量提取。
3．质粒载体经Hind Ⅲ和BamH I双酶切，并进行胶回收。
4．载体与设计合成的干涉片段连接，构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体。
5．用已构建的靶向mrp1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质粒表达载体转化大肠杆菌E.coli DH5α进行菌落PCR，检测重组质粒构建是否正确；重组质粒大量提取，进行OD值检测。
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第2章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 宿主菌
E.coli DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。
2.1.2 质粒载体
pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒由华中科技大学吴政星教授惠赠，该质粒源自Genscript公司（Scotch PlamsUSA）。pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒特性如下：
pRNAT-H1.1/shuttle 是一种腺病毒siRNA穿梭质粒，shRNA的表达由人的转录启动子H1 Promoter启动，H1启动子属于PolⅢ启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成RNA，转录过程遇到4~5个连续的U即终止，非常精确；同时CMV Promoter为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白（Red Fluorescence Protein，RFP）的表达；MCS为多克隆位点。质粒图谱见图2-1
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HindIII (6162)KpnI (6160)BamHI (6144)H1 promoter (6043-6142)CMV Promoter (37-624)Ampcillin (4746-5606)RFP (641-1336)pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP6168 bpPoly A(1351)P1 Sce 1(1802)pUC ori (3958-4598)SV40 Promoter (2064-2409)Neomycin (2450-3244)
图2-1 pRNAT-H1.1/shuttle-RFP质粒图谱 Fig.2-1 Detailed map of pRNAT-H1.1/shuttle-cRFP
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2.1.3 载体通用引物
正向引物（M13）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ 反向引物（Rev）：5′- GAGTTAGCTCACTCATTAGGC -3′
2.1.4 主要试剂及工具酶
质粒快速提取试剂盒
Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒 10×PCR buffer dNTP
Marker(1kb,100bp) Goldview DNA染料 吖啶橙 氨苄青霉素 EDTA 溶菌酶 LiCl RNase bacto-typtone bacto-yeast extract PEG8000 TriS饱和酚 HindⅢ BamHI T4DNA连接酶 Taq酶
2.1.4.1 电泳缓冲液及培养基
1、 50×TAE电泳缓冲液：Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，EDTA（Na2EDTA·2H2O）37.2g溶水，定容至1000mL。
2、10×TBE电泳缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA（5M，pH8.0）20ml，ddH2O定容至500ml。
3、LB液体培养基：将bacto-typtone 2g、bacto-yeast extract 1g和NaCl 2g，溶于195mL
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